人源抗狂犬病毒基因工程抗体亲和力成熟研究

发布时间：2017-07-05 07:14

  本文关键词：人源抗狂犬病毒基因工程抗体亲和力成熟研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus, RV)引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)推荐,对狂犬病Ⅲ级暴露后的预防主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin, RIG)的方法。目前使用的两类RIG为人抗狂犬病毒免疫球蛋白(human rabies immune globulin, HRIG)和马抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equine rabies immune globulin, ERIG)。但ERIG副反应比较严重,而且对某些疫苗的抗体反应有抑制,HRIG价格昂贵,供应量有限并且有潜在的病原威胁。抗狂犬病毒单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAbs)具有中和效果高,安全性好,成本低,可大量生产等优点,能够取代RIG用于狂犬病的暴露后预防。 抗体体外亲和力成熟主要是模拟体内亲和力成熟的过程,采取各种策略对抗体基因进行相应的突变,构建突变抗体库,通过亲和筛选获得高亲和力的抗体。在体外亲和力成熟的过程中,突变策略主要可分为随机突变、置换和定向突变。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,分别通过易错突变和链置换的方法筛选高亲和力的人源抗狂犬病毒中和抗体,实验有以下两部分： 一、人源抗狂犬病毒scFv抗体易错库的构建与筛选 为获得针对狂犬病毒糖蛋白II号表位的高亲和力抗体,我们采用scFv噬菌体展示平台,对一株糖蛋白II号表位中和抗体RV08采用链置换法进行改造。首先将母本抗体RV08的重链和轻链基因克隆入pHAL14载体,以此克隆作为模板进行6-8轮易错PCR。用已随机引入突变的质粒构建scFv噬菌体抗体库,使用高效噬菌体对scFv噬菌体抗体库进行包装。在成功构建scFv噬菌体抗体库的基础上,用纯化的狂犬病毒颗粒CTN株对scFv噬菌体抗体库进行富集筛选,利用ELISA、IFA对所获人源单克隆抗体scFv段基因的功能特性进行鉴定,并通过序列测定确定所获抗体的基因序列,我们获得90株抗狂犬病毒scFv抗体。 二、人源抗狂犬病毒全抗体表达及功能鉴定 将这90株抗体经293T双质粒真核表达系统表达IgG抗体,通过ELISA、IFA方法筛选到5株亲和力较高的针对狂犬病毒糖蛋白的抗体,通过非竞争ELISA方法测定亲和力。结果显示这5株抗体亲和力均能达到10-9M,对狂犬病毒CTN株具有良好的中和活性。其中,HL2、HL37和HL46亲和力分别为1.56x10"9M,1.88x10-9M,1.30×10-9M,略高于RV08。5株抗体轻链和重链的CDR区均有氨基酸发生突变,但重链CDR3区均无突变发生,提示仅通过易错PCR的方法引入少量的突变碱基,很难获得重链CDR3区有意义的氨基酸突变。 综上所述,本研究运用噬菌体易错抗体库技术,构建了人源抗狂犬病毒scFv噬菌体抗体库,筛选获得了90株特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源scFv抗体。其中5株构建为IgG全抗体后显示出高亲和力。这一结果为实现单克隆抗体的亲和力成熟奠定了基础。
【关键词】：狂犬病毒 人源基因工程抗体 亲和力成熟 噬菌体展示技术
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.9
【目录】：

• 缩略说明4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 人源抗狂犬病毒scFv抗体易错库的构建与筛选10-38
• 前言10-13
• 实验材料13-15
• 实验方法15-30
• 实验结果30-35
• 讨论35-37
• 小结37-38
• 第二部分 人源抗狂犬病毒全抗体表达及其亲和力成熟研究38-58
• 前言38-40
• 实验材料40-42
• 实验方法42-47
• 实验结果47-55
• 讨论55-57
• 小结57-58
• 全文总结58-59
• 参考文献59-62
• 综述62-71
• 参考文献66-71
• 攻读硕士期间已发表文章71-72
• 致谢72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 王丁丁;许天敏;余丽江;苏曼曼;黄树林;宿晓云;陈磊;颜炜群;;应用毕赤酵母分泌表达筛选人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc[J];吉林大学学报(医学版);2007年06期

2 王辉;王琰;沈倍奋;;抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展[J];军事医学科学院院刊;2008年02期

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本文编号：520980