miR-34a对树突状细胞发育和功能的影响及机制研究

发布时间：2017-07-05 22:16

  本文关键词：miR-34a对树突状细胞发育和功能的影响及机制研究

  更多相关文章： miRNAs miR-34a 树突状细胞 IL-17a WNT1

【摘要】：microRNAs（miRNAs）是一类长度约为22个核苷酸，参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。近年来研究发现，miRNAs参与了众多的生物学过程，如细胞的增殖分化和凋亡、个体发育和疾病的发生发展。现有的研究表明MiRNAs同样参与了免疫系统的各种细胞的分化发育。为进一步探讨miRNAs在淋巴细胞发育和活化中的作用，通过建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a转基因小鼠模型来进一步研究miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用。为此，首先我们通过q-PCR和流式分析鉴定miR-34a过表达的质粒pMDH-PGK-GFP-miR-34a能成功表达miR-34a。在此基础上，为更好的研究miR-34a对淋巴细胞发育的影响，我们一方面通过制备miR-34a的逆转录病毒，感染骨髓干细胞，并建立miR-34a过表达嵌合小鼠模型，通过FACS和PCR检测证明我们的嵌合小鼠模型成功建立。另一方面，为得到更好的稳定的研究模型，我们将pMDH-PGK-GFP-miR-34a用HindIII酶切线性化，并应用显微注射受精卵细胞制备miR-34a转基因小鼠模型。进一步通过FACS分析发现：无论在嵌合小鼠中，还是在转基因小鼠模型中，我们均发现过表达miR-34a后，其T细胞亚群的比例和其在正常小鼠中发育无显著差异。但我们发现在过表达嵌合小鼠和转基因小鼠中，无论是在骨髓还是在外周的脾脏中，均出现B细胞的显著减少，这个结果和已发表文章结果一致，说明转基因动物模型建立成功。进一步研究发现过表达miR-34a后，无论是在嵌合模型还是在转基因模型中，树突状细胞(DC)及其各亚群细胞（pDC, cDC）都显著高于其在正常小鼠体内的比例。为了研究miR-34a是如何促进DC的发育，进一步的实验结果显示miR-34a并不影响DC细胞的自我更新和凋亡，而是通过促进pre-DC向pDC和cDC发育来实现的。最后，我们通过软件分析和PCR、荧光素酶素报告系统等预测和验证miR-34a在DC发育促进中的作用机制，初步发现，miR-34a可能通过作用于多种基因如E2F2、WNT1等来调控DC的发育。通过在转基因骨髓细胞中过表达WNT1，并构建WNT1和miR-34a的嵌合小鼠我们发现WNT1能够逆转由于过表达miR-34a导致的DC增多。这提示，WNT1是miR-34a的功能性靶基因。 我们进一步通过体外共培养cDC和na ve CD4T细胞发现，，过表达miR-34a的cDC抑制了T细胞的增值。用同样的方法我们发现miR-34a并不影响pDC对T细胞应答。进一步表明miR-34a不是通过影响cDC的抗原提呈和自身成熟来影响T的活化增殖。用实时定量PCR检测发现miR-34a的cDC的IL-17a的水平远远高于其在正常cDC的表达。这提示miR-34a cDC对CD4T细胞的增殖抑制作用可能是通过IL-17a发挥作用的。为了验证是否确实是由于IL-17a导致的这种抑制作用，我们中和抗体中和共培养体系中的IL-17a，结果表明，中和IL-17a能明显消除这种抑制作用。同样我们在cDC与CD4T细胞共培养体系中加入IL-17a，发现IL-17a能够明显的抑制T细胞的增殖。但单独将IL-17a加入抗CD3、CD28活化的T细胞中却不能抑制T细胞的活化。且流式结果表明IL-17a受体高表达在DC细胞表面。提示IL-17a直接作用于DC。有文献报道，WNT1信号下游的一个接头蛋白TCF1对IL-17a的表达有抑制作用，而TCF1有能够抑制一个与IL-17a表达关键的转录因子RORγt的表达，所以我们检测了这两种关键分子是否在这个过程中发挥作用，定量PCR表明TCF1在miR-34a cDC的表达明显下调，而RORγt在cDC的表达明显上调。这提示miR-34a可能通过影响WNT1介导的信号影响了DC产生IL-17a，从而影响DC对T细胞的活化。 总结我们现有的研究，我们成功建立了miR-34a过表达嵌合小鼠和转基因小鼠动物模型，为进一步研究miR-34a的生物学功能提供强有力的研究工具。免疫表型结果提示miR-34a主要促进了pre-DC向pDC, cDC细胞的发育。miR-34a可能通过影响WNT1基因翻译和稳定来调控DC的发育。同时miR-34a通过对WNT1-TCF1-RORγT信号通路调控IL-17a表达，从而影响CD4T细胞的活化增殖。这为阐明DC发育的分子调控提供了新的理论解释，也首次提出DC通过产生高水平的IL-17调控T细胞免疫应答，为免疫应答的调控提出新的理论。
【关键词】：miRNAs miR-34a 树突状细胞 IL-17a WNT1
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 目录11-12
• 前言12-15
• 第一部分 miR-34a 小鼠骨髓嵌合模型与转基因模型的建立15-31
• 一、材料方法15-25
• 二、实验结果25-29
• 三、讨论29-31
• 第二部分 miR-34a 骨髓嵌合小鼠和转基因动物模型的表型分析31-42
• 一、材料方法31-33
• 二、实验结果33-41
• 三、讨论41-42
• 第三部分 miR-34a 促进 DC 分化发育的功能靶基因分析验证42-53
• 一、材料方法42-46
• 二、结果46-51
• 三、讨论51-53
• 第四部分 miR-34a 对 DC 功能影响的研究53-66
• 一、材料方法54-58
• 二、实验结果58-65
• 三、讨论65-66
• 结论66-68
• 参考文献68-71
• 综述71-83
• 参考文献77-83
• 硕士期间完成论文83-84
• 名词缩写表84-86
• 致谢86-87

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3 陈敏;树突状细胞疫苗[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2002年03期

4 张浩,郑树森,蒋国平,谢海洋;小鼠肝癌树突状细胞融合瘤苗促进肿瘤凋亡的实验研究[J];科技通报;2005年02期

5 张吉才,缪继武,杨宁;人外周血树突状细胞对LAK细胞杀伤活性的影响[J];免疫学杂志;1996年04期

6 邱立华;树突状细胞的研究近况[J];上海免疫学杂志;1999年02期

7 王晓,钱振超,裴雪涛;树突状细胞联合自杀基因tk及其效应的研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1999年03期

8 刘欣,张学军,孙自敏,朱薇波;树突状细胞与抗肿瘤免疫[J];国外医学.肿瘤学分册;2000年06期

9 董薇,蔡美英;树突状细胞与T细胞免疫反应结果研究进展[J];中国免疫学杂志;2005年02期

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1 刘修恒;;小鼠骨髓源性不同成熟度树突状细胞培养鉴定[A];第十七届全国泌尿外科学术会议论文汇编[C];2010年

2 张庆红;胡玉珍;吕顺艳;钟延清;;雌激素影响大鼠树突状细胞的分化、成熟和功能[A];中国生理学会第六届全国青年生理学工作者学术会议论文摘要[C];2003年

3 郭大伟;梁健;姜晓峰;王学范;魏云涛;姜洪磊;;GPC3基因转染的树突状细胞诱导抗肝癌HepG2细胞杀伤作用的研究[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年

4 张新华;钟翠平;顾云娣;顾晓;范强;王国强;周播江;;TGF-β1基因转染树突状细胞增强移植心脏耐受性并降低Fractalkine的表达[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

5 于益芝;刘书逊;王文雅;张明徽;郭振红;徐红梅;齐润姿;安华章;曹雪涛;;TRAIL在树突状细胞杀伤活化T细胞中的作用[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

6 尤长宣;罗荣城;张军一;苏瑾;廖旺军;郑航;Paul L Hermonat;;基因转移制备树突状细胞的实验研究[A];第一届中国肿瘤靶向治疗技术大会论文集[C];2003年

7 葛长勇;李鸿钧;孙茂盛;冯婷婷;靳昌忠;姚航平;吴南屏;;灭活SV40致敏的猴树突状细胞的生物学特性研究[A];2008年浙江省感染病、肝病学术年会论文汇编[C];2008年

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本文编号：523831