利用微小基因组建立评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统

发布时间：2017-07-07 20:29

  本文关键词：利用微小基因组建立评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统

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【摘要】：丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）属于黄病毒科（Flaviviridae），肝炎病毒属（Hepacivirus），是引起慢性肝病的主要病原体之一。HCV感染呈全球流行状态，是导致肝硬化和肝癌的最主要病因，约有1.3亿HCV感染者。HCV为单正链RNA病毒，基因组全长约为9.6kb，两端含有5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR），，中间为一个开放阅读框（ORF）。开放阅读框可编码一个多聚蛋白前体，然后在宿主与病毒蛋白酶的共同作用下加工成为3个结构蛋白和7个非结构蛋白。结构蛋白分别为核心蛋白（Core）、包膜糖蛋白E1和E2，非结构蛋白分别为p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非结构蛋白NS5B具有RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependent RNApolymerase，RdRp）活性，是HCV RNA合成和复制的关键酶，是抗HCV治疗的关键靶点。随着对病毒基因组复制机制的深入理解，利用RNA病毒的反向遗传技术建立的微小基因组系统为研究HCV的复制、与宿主细胞之间的相互作用、致病机制以及抑制剂的筛选提供了新的工具，进一步为建立HCVNS5B抑制剂的高通量筛选体系提供了技术支撑。因此，本研究利用HCV NS5B的RdRp活性和反向遗传技术，建立可评价HCV NS5B聚合酶活性的新型细胞系统，为HCV NS5B抑制剂的高通量筛选提供新的实验系统。 基于目前国内外学者对于HCV复制机理的最新进展，并且以本室前期的研究为基础，首先分别设计并且构建了真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP、微小基因组(-)5UIRrG(-)3U和真核表达质粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。然后通过将pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz质粒共转染BHK-21细胞，检测细胞中萤火虫荧光素酶（FLuc）活性，对pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中NS5B活性进行了验证。通过将pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U和pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP质粒共转染BHK-21细胞，检测细胞培养上清及细胞中的Gaussia荧光素酶（GLuc）活性，对微小基因组(-)5UIRrG(-)3U的功能进行了鉴定。主要研究结果如下： 1.成功构建了表达HCV NS3-5B复制复合体的质粒并鉴定了NS5B聚合酶的活性 （1）通过PCR方法扩增HCV NS3-5B全长基因片段，然后成功构建了真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP。酶切鉴定以及测序比对正确后，转染至BHK-21细胞，荧光成像可以观察到绿色荧光蛋白的表达，Western Blot检测结果显示NS3-4A蛋白和NS5B蛋白均在细胞中得到表达。 （2）重组质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz（本室前期构建）共转染至BHK-21细胞中，结果显示所构建的真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中的NS5B具有RdRp活性，并且NS3-5B复制复合体中的NS5B活性明显高于单独的NS5B活性。 2.成功构建了(-)5UIRrG(-)3U微小基因组并鉴定了其功能 （1）设计了一段两端含有HCV负链5′UTR和负链3′UTR序列，中间含有EMCVIRES-DsRed2正向序列和GLuc编码基因的反向互补序列（rvGLuc）的微小基因组片段(-)5UIRrG(-)3U。分别设计扩增各基因片段的上下游引物，然后利用重叠延伸PCR技术将扩增出的各基因片段成功拼接。琼脂糖凝胶电泳结果显示各基因片段大小正确。 （2）成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。酶切鉴定以及测序比对正确后，转染至BHK-21细胞后，红色荧光蛋白得到表达，细胞内重组质粒中的微小基因组具有正常的功能。 3.初步建立了评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统 在pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U重组质粒共转染的BHK-21细胞中，荧光成像可以观察到绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白同时得到表达，并且位于复制复合体中的NS5B蛋白可以使微小基因组片段进行正常的复制和转录，GLuc得到表达并且分泌至细胞培养液中，进而可以通过检测GLuc的活性来评价NS5B聚合酶的活性。 综上所述，本研究成功构建了HCV NS3-5B的真核表达载体和含有报告基因的微小基因组载体，将两者组合初步建立了评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统。此系统为建立NS5B抑制剂的高通量筛选系统提供了新的途径，并且进一步为利用该系统建立可用于HCV NS5B抑制剂筛选和评价的转基因动物模型提供了实验依据。
【关键词】：丙型肝炎病毒（HCV） NS5B 微小基因组 抑制剂筛选系统
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.2
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-30
• 一、HCV 的基因组与编码蛋白的功能17-22
• 二、HCV RNA 的翻译与复制机制22-25
• 三、HCV 微小基因组的研究25-27
• 四、NS5B 聚合酶活性评价系统与抑制剂的筛选27-30
• 第一部分 表达 NS3-5B 蛋白的真核表达质粒构建及 NS5B 聚合酶活性鉴定30-46
• 1 实验材料与仪器30-32
• 1.1 质粒、菌株及细胞株30
• 1.2 主要试剂30-31
• 1.3 主要仪器31-32
• 2 实验方法32-40
• 2.1 引物设计及合成32
• 2.2 重组质粒 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 的构建及鉴定32-36
• 2.3 细胞培养36
• 2.4 细胞转染及荧光成像观察36
• 2.5 Western Blot 检测36-38
• 2.6 细胞转染及萤火虫荧光素酶（FLuc）活性检测38-39
• 2.7 统计学分析39-40
• 3 实验结果40-43
• 3.1 重组质粒 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 酶切鉴定及序列分析结果40
• 3.2 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 转染细胞后荧光成像结果40-41
• 3.3 HCV 非结构蛋白 NS3-4A 和 NS5B Western Blot 检测结果41-42
• 3.4 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 和 pCMV/5UrFI3URz 共转染细胞后 FLuc 活性测定结果42-43
• 4 讨论43-46
• 第二部分 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 重组质粒构建及功能鉴定46-73
• 1 实验材料与仪器46-47
• 1.1 质粒、菌株及细胞株46
• 1.2 主要试剂46-47
• 1.3 主要仪器47
• 2 实验方法47-61
• 2.1 引物的设计及合成47-48
• 2.2 微小基因组片段(-)5UIRrG(-)3U 的拼接48-54
• 2.3 重组质粒 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 的构建及鉴定54-57
• 2.4 细胞培养57
• 2.5 细胞转染及荧光成像观察57-59
• 2.6 细胞转染及 Gaussia 荧光素酶（GLuc）活性检测59-61
• 2.7 统计学分析61
• 3 实验结果61-68
• 3.1 微小基因组(-)5UIRrG(-)3U 构建示意图61
• 3.2 微小基因组(-)5UIRrG(-)3U 各片段 PCR 扩增结果61-63
• 3.3 重组质粒 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 酶切鉴定及序列分析结果63-64
• 3.4 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 转染细胞后荧光成像结果64-65
• 3.5 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 和 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 共转染细胞后荧光成像结果65-66
• 3.6 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP 和 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U 共转染细胞后 GLuc 活性测定结果66-68
• 4 讨论68-73
• 小结73-74
• 参考文献74-85
• 个人简历和研究成果85-86
• 致谢86-87

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 尹伟;李成忠;;慢性丙型肝炎抗病毒治疗进展[J];世界临床药物;2013年12期

2 韩佩君;雷迎峰;吕欣;杨敬;姚敏;乔卿华;党品香;尹文;;丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3-5B蛋白的真核表达载体构建及其在BHK-21细胞中的表达[J];科学技术与工程;2013年36期

3 高炜;邵伟;苏刚;李佳;谢小冬;;蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用[J];科技导报;2014年Z1期

4 任华;陆威;

本文编号：531755