大肠杆菌诱导家蝇幼虫差异基因的原核表达及体外抑菌活性检测

发布时间：2017-07-08 10:22

本文关键词：大肠杆菌诱导家蝇幼虫差异基因的原核表达及体外抑菌活性检测

【摘要】：由于临床上抗生素的广泛不合理应用，导致耐药菌株甚至是超级细菌的出现，严重影响了人类及动物的健康，研发出一种高效且不易使细菌产生耐药性的新型抗菌制剂是目前急需解决的问题。家蝇（Musca domestica）生长环境恶劣，携带许多病原菌，自身却不染病，缘于其体内存在的抗菌活性物质，家蝇抗菌肽就是其中之一。家蝇抗菌活性物质作用机理独特，且不易使细菌产生耐药性，一定程度上可能代替传统抗生素，已广泛引起人们的关注。本研究以鸡源致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库（SSH）中筛选得到的差异表达基因为基础，，以其cDNA为模板，利用RACE-PCR技术对家蝇溶菌酶1基因（Musca domestica lysozyme1,MdL1）及3个未知功能基因（unknown functional gene ofMusca domestica,Md-UF1, Md-UF2, Md-UF3）进行扩增，产物测序及生物信息学分析。通过T-A克隆技术，将全长PCR产物克隆至pMD18-T载体中，成功构建pMD18-T-Md-UF1、pMD18-T-Md-UF2、pMD18-T-Md-UF3、pMD18-T-MdL1克隆质粒。将pMD18-T-Md-UF1、pMD18-T-Md-UF2、 pMD18-T-Md-UF3、 pMD18-T-MdL1基因亚克隆至pET-32a和pGEX-4T-1表达载体中，构建出重组表达质粒，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳分析。利用亲和层析法对融合蛋白进行纯化，将纯化产物进行体外抑菌活性分析，实验主要结果如下：（1）利用RACE技术成功扩增出Md-UF1、Md-UF2、Md-UF3及MdL1基因的全长cDNA序列，其ORF序列大小分别为840bp，990bp，297bp，432bp。（2）核苷酸及氨基酸序列分析结果表明：Md-UF1、Md-UF2、Md-UF3基因尚未发现与其有同源性的基因序列；MdL1基因的mRNA全序列与GenBank登录号为AY344589.1的同源性为96%，有5个氨基酸的差异。Md-UF1基因编码279个氨基酸，呈亲水性，不含有信号肽，二级结构包含无规则卷曲，α-螺旋及β-折叠；Md-UF2基因编码329个氨基酸，呈亲水性，不含有信号肽，二级结构包含无规则卷曲及β-折叠；Md-UF3基因编码98个氨基酸，呈亲水性，有信号肽，二级结构包含无规则卷曲，α-螺旋及β-折叠；MdL1基因编码143个氨基酸，呈亲水性，有信号肽，二级结构包含无规则卷曲，α-螺旋及β-折叠。（3）成功构建了pET-32a-Md-UF1、 pET-32a-Md-UF2、 pGEX-4T-1-Md-UF2、pET-32a-Md-UF3、pGEX-4T-1-Md-UF3、pET-32a-MdL1和pGEX-4T-1-MdL1重组表达质粒。经IPTG诱导，pGEX-4T-1-Md-UF2、pET-32a-Md-UF1、pET-32a-Md-UF3和pET-32a-MdL1成功在大肠杆菌中表达。表达产物纯化得到比较单一的融合蛋白，其抑菌实验结果表明，Trx-6His-Md-UF1、GST-Md-UF2、Trx-6His-MdL1融合蛋白均对临床分离的鸡源大肠杆菌耐药株具有明显的抑制作用；Trx-6His-Md-UF1、GST-Md-UF2融合蛋白对临床分离的鸡伤寒沙门氏菌耐药株有抑制作用；Trx-6His-Md-UF3融合蛋白对其抑制作用不明显；四种融合蛋白均对猪源链球菌无抑制作用。上述实验结果，为进一步研究这四种融合蛋白抗菌活性机制奠定基础，为临床寻找新型抗菌药物提供依据。
【关键词】：家蝇抗菌肽 大肠杆菌 克隆 原核表达 抑菌活性
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R384.2
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