骨髓间充质干细胞（BMSCs）对肾小球足细胞mTOR的作用研究

发布时间：2017-07-13 11:07

  本文关键词：骨髓间充质干细胞（BMSCs）对肾小球足细胞mTOR的作用研究

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【摘要】：一、骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 目的：通过Ficoll密度梯度离心和贴壁分离法体外分离、培养适合实验研究的骨髓间充质干细胞 方法： 1，无菌条件下取出健康雄性SD大鼠股、胫骨,采用Ficoll密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化BMSCs，显微镜下观察细胞形态和生长情况。传至P3代时，细胞计数并鉴定。 2.用成脂、成骨诱导试剂诱导BMSCs向成脂和成骨分化，用油红O染色检测成脂细胞，用VonKossa染色法染色检测成骨细胞。 3.用流式细胞鉴定BMSCs表面的抗原标志物CD29、CD34、CD45、CD90。结果:镜下观察BMSCs呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小一致。BMSCs加入成骨和成脂诱导剂后诱导出成骨和成脂细胞。BMSCs流式细胞仪检测其抗原标志物提示CD29、CD90强阳性，低表达CD45、CD34，细胞纯度高。 结论：采用Ficoll密度梯度离心和体外细胞贴壁分离培养法相结合提取的BMSCs，稳定性好，活性高，可以达到实验要求。 第二部分足细胞原代的分离、培养及鉴定 目的：通过过筛法分离肾小球，胰酶消化破膜后，并进行足细胞原代培养，建立稳定的足细胞原代培养方法，供实验使用。 方法：1.无菌条件下取出雄性SD大鼠两侧肾脏，剪碎肾皮质后，用80目，150目，200目网筛分离肾小球，并用光学显微镜下观察肾小球形态。 2.收集并用Ⅳ型胶原酶消化肾小球，种植在用Ⅰ型胶原包被的培养瓶中培养，5d后在在显微镜下观察肾小球形态。 3.测定细胞表面的上neprin和WT-1抗原。 结果：用过筛法可分离出高纯度的肾小球，并用Ⅳ型胶原酶消化后种植在培养瓶中3天后从肾小球中爬出成鹅卵石样细胞，，所提取的细胞经足细胞特异性表位WT-1和nephrin鉴定为足细胞。 结论：用过筛法结合Ⅳ型胶原酶消化法能培养出细胞，经鉴定培养出的细胞为符合实验要求足细胞。 第三部分骨髓间充质干细胞（BMSCs）对肾小球足细胞mTOR的作用研究。 目的：探讨BMSCs对保护嘌呤霉素损伤足细胞的作用研究及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在此过程中的表达； 方法： 实验分组： 正常组：足细胞； 嘌呤霉素组：足细胞+嘌呤霉素(5ug/ml)； 干细胞组：足细胞+BMSCs（共培养24h）+嘌呤霉素(5ug/ml)； 各实验组干预3h后通过普通RT-PCR检测nephrin mRNA和用Western-Blot技术检测nephrin、mTOR、p-mTOR蛋白的的表达。 结果： 1、普通人体RT-PCR电泳示：正常组、嘌呤霉素组、干细胞组nephrin mRNA的表达无明显差异。 2. Western bolt结果示：正常组、嘌呤霉素组、干细胞组nephrin蛋白的表达无明显差异；嘌呤霉素组相比正常对照组p-mTOR蛋白的表达上调；干细胞组与嘌呤霉素组相比p-mTOR蛋白表达明显降低。 结论：BMSCs保护嘌呤霉素损伤的足细胞作用可能与mTOR信号转导途径有关。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 Ficoll密度梯度离心法 VonKossa染色法 足细胞 nephrin蛋白 过筛法 骨髓间充质干细胞 足细胞 嘌呤霉素 哺乳动物雷帕霉素蛋白
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 目录3-4
• 英文缩略4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分： 大鼠 BMSCs 的提取、培养及鉴定14-25
• 引言14
• 材料与设备14-15
• 方法15-20
• 结果20-23
• 讨论23-24
• 小结24-25
• 第二部分： 大鼠肾脏足细胞的提取、培养及鉴定25-32
• 引言25
• 材料与设备25-26
• 方法26-28
• 结果28-30
• 讨论30-31
• 小结31-32
• 第三部分： 大鼠 BMSCs 对肾小球足细胞 mTOR 的作用研究32-42
• 引言32
• 材料与设备32-35
• 方法35-39
• 结果39-41
• 讨论41-42
• 小结42
• 参考文献42-47
• 致谢47-48
• 综述48-55
• 参考文献52-55
• 在校期间发表论文情况55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：536671