耻垢分枝杆菌ligD和ku突变株的构建

发布时间：2017-07-13 19:16

  本文关键词：耻垢分枝杆菌ligD和ku突变株的构建

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【摘要】：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)可引起结核病,是微生物中人类最大的敌人,据世界卫生组织预测全球三分之一的人口感染了MTB, WHO的数据显示,2011年全球新发现有870万感染者患病,其中有110万患者同时感染艾滋病毒,估计有140万人死于结核病。因与艾滋病毒共同感染人体造成死亡的数目之巨,MTB已成为传染病中的头号杀手。虽然现已开发几种抗结核类药物但由于耐药性的产生,这些药物的控制效果远远达不到令人满意的效果。结核病是一个从未解决的麻烦。 DNA双链断裂是普遍存在的一种DNA损伤,但其对于细胞来说是致命的。修复DNA双链断裂的途径有同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)。NHEJ最早是在哺乳动物细胞中发现的,并一直被认为只存在于真核生物中,其在真核生物中对保持基因组的稳定性有很重要的作用。但之后的研究发现NHEJ也普遍存在于一些病原微生物中,且与耐药和免疫逃避相关。 现已知NHEJ修复途径涉及两个蛋白LigD和Ku,同时对这两个蛋白的功能也有了一定的了解,而在NHEJ修复过程中,LigD同Ku的作用机制及调控方式还不是很明确。本实验室前期研究发现去乙酰化酶Sir2可能参与NHEJ修复途径,还发现Ku的29位赖氨酸有乙酰化修饰,这暗示了NHEJ修复的调控可能同Ku的K29乙酰化修饰有关。 我们以耻垢分枝杆菌做为模式生物使用无标记基因敲除法来构建ligD和ku两个基因的不同突变体ligD ΔPolDom、TBku-his、ku-his、kuR29-his和kuQ29-his。无标记基因敲除需要两个质粒,一个质粒为p1NIL,为目的基因提供多克隆位点,第二个质粒pGOAL,含有一个两端为PacI酶切位点的标记基因盒。标记基因盒里有抗生素抗性基因、lacZ和sacB。构建成的自杀质粒含有pGOAL质粒的标记基因盒和修饰过的目的基因,最后经过两次筛选得到我们所要的突变体。实验结果发现同源臂的长度、碱处理质粒时碱的终浓度、沉淀DNA溶液的pH等条件和第二次筛选的扩增培养时间等都影响双交换法突变株的构建。同时也发现M. smegmatis Ku的C端加His标签不影响其参与的NHEJ活性,这为后面检测耻垢分枝杆菌ku突变株(kuR29-his和kuQ29-his)的NHEJ活性时,消除His标签引起NHEJ活性改变的影响。这些突变体为研究NHEJ修复的调控方式提供了重要的材料。
【关键词】：耻垢分枝杆菌 非同源末端连接 Ku LigD 突变株
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 目录4-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 缩略语表10-11
• 1 前言11-29
• 1.1 结核分枝杆菌及其危害11-13
• 1.1.1 结核分枝杆菌11-12
• 1.1.2 结核分枝杆菌的危害12-13
• 1.2 结核分枝杆菌中的DNA修复13-15
• 1.3 真核生物的NHEJ15-18
• 1.3.1 真核中蛋白组成和互作16
• 1.3.2 真核NHEJ修复机制16-18
• 1.4 原核生物的NHEJ18-22
• 1.4.1 Ku蛋白19-20
• 1.4.2 LigD蛋白20-22
• 1.4.2.1 POL结构域21
• 1.4.2.2 LIG结构域21
• 1.4.2.3 PE结构域21-22
• 1.5 结核分枝杆菌中的NHEJ22-25
• 1.6 蛋白质的乙酰化修饰25
• 1.7 基因敲除原理25-28
• 1.8 研究目的与意义28-29
• 2 材料和方法29-43
• 2.1 材料29-33
• 2.1.1 质粒与菌株29-30
• 2.1.2 培养基30
• 2.1.3 主要试剂30
• 2.1.4 主要溶液30-32
• 2.1.5 主要实验仪器32-33
• 2.2 方法33-43
• 2.2.1 目的片断的克隆33-36
• 2.2.1.1 构建pZY73质粒的目的基因片段33-34
• 2.2.1.2 构建pZY75质粒的目的基因片段34-35
• 2.2.1.3 构建pZY91质粒的目的基因片段35-36
• 2.2.2 电转质粒的构建36-38
• 2.2.2.1 p1NIL与pGOAL质粒的制备36-37
• 2.2.2.2 p1NIL质粒的酶切37
• 2.2.2.3 目的片段与酶切后的p1NIL连接37
• 2.2.2.4 p1NIL-目的片段重组质粒的转化37-38
• 2.2.2.5 PacⅠ酶切重组质粒与pGOAL质粒38
• 2.2.2.6 pGOAL质粒与p1NIL-target gene的连接38
• 2.2.2.7 电转质粒载体的转化38
• 2.2.3 基因敲除38-40
• 2.2.3.1 感受态的制备38-39
• 2.2.3.2 质粒的预处理39
• 2.2.3.3 电转39-40
• 2.2.3.4 第二次筛选40
• 2.2.4 突变体阳性检测40-43
• 2.2.4.1 PCR验证第二次筛选40
• 2.2.4.2 Western Blot验证40-41
• 2.2.4.3 M.smegmatis ku-his菌株中的Ku-His蛋白纯化41-42
• 2.2.4.4 SDS-PAGE分析蛋白纯度和分子量42
• 2.2.4.5 NHEJ效率检测42-43
• 3 结果与分析43-51
• 3.1 目的片段的构建43-44
• 3.1.1 pZY73质粒的目的基因片段43
• 3.1.2 pZY75质粒的目的基因片段43-44
• 3.1.3 pZY91质粒的目的基因片段44
• 3.2 p1NIL与pGOAL质粒的酶切44-45
• 3.3 pZY73、pZY75与pZY91质粒酶切验证45-46
• 3.4 碱处理的条件46-47
• 3.5 第二次筛选47
• 3.6 第二次筛选后菌落PCR验证47-48
• 3.7 第二次筛选后菌落Western Blot验证48-49
• 3.8 M smegmatis mc~2 155 ku-his菌株的Ku-His蛋白的大量纯化49
• 3.9 NHEJ修复效率检测49-51
• 4 讨论51-53
• 参考文献53-58
• 致谢58

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