重组人转氨酶标准物质及人巨细胞病毒IgG抗体国家参考品的研制

发布时间：2017-07-19 09:26

  本文关键词：重组人转氨酶标准物质及人巨细胞病毒IgG抗体国家参考品的研制

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【摘要】：目的 通过采用基因重组的技术表达的谷丙转氨酶蛋白和谷草转氨酶蛋白研制人谷丙转氨酶和谷草转氨酶混合标准品，用于临床检验实验室以及谷丙转氨酶和谷草转氨酶试剂盒的质量控制。通过以正常人的血清为原料研制人巨细胞病毒IgG抗体参考品，用于临床检验实验室和人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒的质量控制。 方法 一、重组人转氨酶标准物质的研制 1、目的基因的获得。从NCBI网站上查询人谷丙转氨酶蛋白和人谷草转氨酶蛋白的序列，根据大肠杆菌偏爱密码子表，对查找的序列进行优化，并将优化成功的基因序列送生物公司合成。 2、表达菌株构建。通过双酶切的方法将合成的基因从复制型载体上切下，连接入表达载体PRSF-Duet，构建出表达载体PRSF-ALT和PRSF-AST，并转化至大肠杆菌BL21中，构建出基因工程菌株。 3、蛋白的表达、纯化及活性测定。用IPTG诱导蛋白的表达，对蛋白诱导表达过程中所需的IPTG浓度和诱导温度进行探索，并对表达的蛋白通过亲和层析和分子筛层析的方法进行纯化，获得人谷丙转氨酶蛋白和人谷草转氨酶蛋白，并对获得的谷丙转氨酶和谷草转氨酶蛋白进行活性测定。 4、基质血清的处理。对收集的正常人血清进行血源筛查后，对合格血清进行去纤维化处理以制备转氨酶的基质。 5、标准品的制备。将制备的谷丙转氨酶蛋白和谷草转氨酶蛋白按一定浓度加入基质血清中，混匀，并分装至1.5mL的冻存管中完成标准品的制备。 6、标准品的稀释。同时用3份转氨浓度不同的血清和生理盐水对标准品进行稀释，将稀释后的样品进行测定。统计分析测定结果。 7、标准品的评价。对制备的标准品进行均匀性和稳定性的评价。 8、标准物质的定值以及不确定度的评估。将研制的待测标准物质通过三家转氨酶参考实验室，用IFCC参考方法对转氨酶标准品进行定值。对研制的转氨酶标准品的不确定度进行评估。 二、人巨细胞病毒IgG抗体参考品的研制 9、参考品原料的获得。将收集的血浆进行去纤维化处理并进行血源筛查试验，用人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒对收集的血清进行筛选，筛选出10份人巨细胞病毒IgG抗体阳性血清和5份人巨细胞病毒IgG抗体阴性血清。 10、参考品原料的确认和复核。用间接免疫荧光和Westernblot的方法对参考品原料进行确认，用国内外的试剂盒对参考品原料进行复核。 11、参考品的验证。用国内外六家公司生产的试剂盒对制备的参考品从准确性、特异性以及灵敏度三个方面进行评价。 12、参考品稳定性的考察。用人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒对参考品在不同条件下的稳定性进行考察。 结果 通过对人谷丙转氨酶基因和人谷草转氨酶基因序列进行优化，并将转氨酶基因克隆至PRSF-Duet载体中，将载体转化至大肠杆菌BL21菌体中，成功表达了人谷丙转氨酶蛋白和谷草转氨酶蛋白，通过蛋白的纯化得到了活性为80000U/L的谷丙转氨酶蛋白和活性为136000U/L的谷草转氨酶蛋白，将转氨酶蛋白制成转氨酶标准品，通过对转氨酶标准品进行评价，得出转氨酶标准品均匀性良好、稳定性良好。最后对标准品进行定值和不确定度评估，得出谷丙转氨酶活性为1020.5U/L，不确定度为194.40U/L。谷草转氨酶活性为792.9U/L，不确定度为78.37U/L。 用试剂盒筛选出人巨细胞病毒IgG抗体的阳性血10份，阴性血5份，用两家不同的试剂盒对筛选的血清进行复核，结果符合预期，用免疫印迹和免疫荧光实验对筛选的血清进行确认，结果符合要求。将确认正确的血清制成人巨细胞病毒IgG抗体参考品盘，，并用不同公司的试剂盒对参考品盘进行验证。验证结果符合要求，采用人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒对参考品的盘的稳定性进行考察，结果表明参考品盘的稳定性良好。 结论 成功研制出了重组人转氨酶标准品填补了我国重组转氨酶标准品的空白，成功研制出人巨细胞病毒IgG抗体参考品。研制的标准品和参考品可用于临床检验实验室和相关的体外诊断试剂盒的质量控制。
【关键词】：谷丙转氨酶 谷草转氨酶 标准品 人巨细胞病毒 IgG抗体 参考品盘
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 目录2-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 英文缩略词14-15
• 第一章 重组人转氨酶标准物质的研制15-88
• 1 概述15-17
• 1.1 转氨酶概述15
• 1.2 临床上转氨酶活性的测定15-16
• 1.3 转氨酶标准品研制的现状16
• 1.4 转氨酶标准物质研制的理论依据16-17
• 2 试验材料和方法17-42
• 2.1 试验材料17-22
• 2.1.1 试验仪器17-18
• 2.1.2 试验耗材18
• 2.1.3 生物材料18
• 2.1.4 工具酶和主要试剂18-20
• 2.1.5 溶液的配制20-22
• 2.2 试验方法22-42
• 2.2.1 目的基因的获得22-23
• 2.2.2 基因工程表达菌株的构建23-27
• 2.2.3 目的蛋白的诱导表达27-30
• 2.2.4 目的蛋白的提取与纯化30-34
• 2.2.5 目的蛋白活性的测定34
• 2.2.6 标准物质基质血清的处理34-35
• 2.2.7 标准物质的制备35-36
• 2.2.8 标准品稀释液的选择36
• 2.2.9 标准物质的瓶内均匀性评价36-37
• 2.2.10 标准物质的瓶间均匀性评价37
• 2.2.11 标准物质的冻融稳定性评价37-38
• 2.2.12 标准物质在4℃储存条件下稳定性评价38
• 2.2.13 标准物质在常温放置条件下稳定性评价38-39
• 2.2.14 标准物质的长期稳定性评价39
• 2.2.15 标准物质的定值39-40
• 2.2.16 标准物质不确定性的评估40-42
• 3 试验结果42-80
• 3.1 目的基因的获得42-52
• 3.1.1 谷丙转氨酶基因的获得42-47
• 3.1.2 谷草转氨酶基因片段的获得47-52
• 3.2 质粒构建结果52-55
• 3.2.1 构建质粒图谱52-53
• 3.2.2 酶切验证的结果53
• 3.2.3 测序验证的结果53-55
• 3.3 目的蛋白的诱导表达55-59
• 3.3.1 蛋白质电泳结果55-56
• 3.3.2 Westernblot验证试验结果56-57
• 3.3.3 诱导条件对目的蛋白表达量的影响57-59
• 3.4 蛋白可溶性鉴定59-61
• 3.4.1 蛋白质电泳结果59-60
• 3.4.2 Westernblot试验结果60-61
• 3.5 分子筛层析结果61-62
• 3.6 蛋白的最终鉴定62-64
• 3.6.1 蛋白质电泳结果62-63
• 3.6.2 Westernblot试验结果63-64
• 3.7 转氨酶溶液活性的测定64
• 3.8 基质血清血源筛查结果64-65
• 3.9 标准品稀释液的选择65
• 3.10 转氨酶标准品的瓶内均匀性评价评价结果65-66
• 3.11 标准品的瓶间均匀性评价结果66-68
• 3.12 标准品的冻融稳定性评价结果68-70
• 3.13 转氨酶标准品的4℃储存稳定性评价结果70-72
• 3.14 转氨酶标准品的室温放置稳定性评价结果72-74
• 3.15 转氨酶标准品的长期稳定性评价结果74-76
• 3.16 转氨酶的定值结果76-77
• 3.17 标准物质的不确定性评估结果77-79
• 3.17.1 测量不确定度（Uchar）对总不确定度的贡献77-78
• 3.17.2 瓶间不确定度（Ubb）对总不确定度的贡献78-79
• 3.17.3 长期稳定性不确定度（Uchar）对总不确定度的贡献79
• 3.17.4 转氨酶标准品总不确定度的计算79
• 3.18 本节总结79-80
• 4 本章讨论80-88
• 4.1 目的基因的优化80-81
• 4.2 表达载体的选择81
• 4.3 蛋白诱导条件的探索81-82
• 4.4 目的蛋白的纯化82-83
• 4.5 标准品基质的处理83
• 4.6 标准物质均匀性评价83-84
• 4.7 标准物质的稳定性评价84-85
• 4.8 标准物质定值与不确定性评估85-86
• 4.9 小结86-88
• 第二章 人巨细胞病毒（HCMV）IgG抗体参考品研制88-108
• 1. 概述88-93
• 1.1 巨细胞病毒的生物学特性88-89
• 1.2 人巨细胞病毒感染的传播途径89
• 1.3 人巨细胞病毒对人类的损害89-90
• 1.4 人巨细胞病毒感染的防治90
• 1.5 人巨细胞病毒感染的诊断方法90-93
• 1.6 人巨细胞病毒IgG抗体参考品研制的意义93
• 2 材料和方法93-99
• 2.1 试验仪器与试剂93-94
• 2.1.1 试验仪器93
• 2.1.2 试验试剂93
• 2.1.3 生物材料93-94
• 2.2 试验方法94-99
• 2.2.1 收集血浆的处理94
• 2.2.2 血清的筛选94
• 2.2.3 血清的血源筛查试验94-95
• 2.2.4 筛选血清的复核95-96
• 2.2.5 筛选血清的确认96
• 2.2.6 人巨细胞病毒IgG参考品盘的制备96-97
• 2.2.7 人巨细胞病毒IgG抗体参考品盘验证97
• 2.2.8 人巨细胞病毒IgG抗体参考品盘稳定性考察97-99
• 3 试验结果99-105
• 3.1 血清的筛选试验结果99
• 3.2 血源筛查实验结果99-100
• 3.3 血清复核试验结果100-101
• 3.4 筛选血清的确认试验101-103
• 3.4.1 间接免疫荧光试验结果101-102
• 3.4.2 Westernblot试验结果102-103
• 3.5 灵敏度参考品的确定试验结果103
• 3.6 参考品盘的验证结果103-104
• 3.7 参考品盘的稳定性考察结果104-105
• 4 本章讨论105-108
• 4.1 参考品盘原料的选择105-106
• 4.2 筛选血清的复核与确认106
• 4.3 灵敏度参考品的确定106
• 4.4 参考品盘的稳定性考察106-108
• 文章结论108-109
• 参考文献109-113
• 文献综述113-125
• 参考文献121-125
• 发表学术论文与申请国家专利情况125-126
• 致谢126-127

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：562176