温度对大鼠腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞活力和功能的影响

发布时间：2017-07-19 11:12

  本文关键词：温度对大鼠腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞活力和功能的影响

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【摘要】：肥大细胞通常被认为是IgE介导的过敏性疾病中关键的效应细胞,最近研究表明,它在调节先天和适应性免疫反应,自身免疫,耐受移植排斥,促进或抑制癌症发生发展等方面都具有一定的作用。肥大细胞可合成和分泌多种细胞因子和生物活性物质,包括组胺、肝素、肿瘤坏死因子、血小板活化因子以及白细胞介素等。此外,肥大细胞的颗粒内还含有类胰蛋白酶和糜蛋白酶等重要的蛋白水解酶。受外源性或内源性刺激后,肥大细胞会脱颗粒释放上述生物活性物质,驱动过敏反应,或诱导成纤维细胞增生,促进胶原合成,参与病理性纤维化进程,还可引发炎症反应。肥大细胞通常位于结缔组织以及皮肤、呼吸道和胃肠道等器官的粘膜层。人体核心温度为37℃,平均皮肤温度为34℃,肥大细胞分布位置的温度通常介于这两者之间。温度的不同可能会引起肥大细胞活力和功能的不同,致使肥大细胞脱颗粒,产生一系列反应。RBL-2H3细胞系是体外研究肥大细胞功能的重要工具,但也有研究表明RBL-2H3细胞与肥大细胞之间存在一定差异。鉴于此,本实验以大鼠腹腔提取的肥大细胞和RBL-2H3细胞作为研究对象,探讨不同温度对肥大细胞活力和功能的影响,同时比较原代培养的肥大细胞和RBL-2H3细胞在体外研究中的差异。研究目的：探究不同温度对于大鼠腹腔提取的肥大细胞和RBL-2H3细胞活力和功能的影响研究方法：1.选用体重220-250 g的SD雄性大鼠,使用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠腹腔肥大细胞,采用甲苯胺蓝染色,c-kit抗体标记、流式细胞术鉴定细胞纯度。2.选取培养2h,4h,6h,12h,24 h,48 h,72 h时间点,CCK8法检测35。C和37℃培养条件下的腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞增殖活力的变化。3.35℃和37℃下培养腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞,使用外源性刺激物C48/80和IgE刺激细胞脱颗粒,并使用肥大细胞稳定剂色甘酸钠抑制细胞脱颗粒。4.底物显色法测定外源性刺激物作用后腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶释放率。5.ELISA方法测定外源性刺激物作用后腹腔提取的肥大细胞及RBL-2H3细胞组胺含量,计算组胺释放率研究结果：1.通过改良密度梯度离心法提取纯化大鼠腹腔肥大细胞,鉴定肥大细胞纯度,甲苯胺蓝染色结果显示细胞纯度达到95%,细胞活性良好。2.35℃和37℃培养条件下,培养2h时腹腔肥大细胞增殖活力无显著性差异,2h之后,35℃培养条件下的腹腔肥大细胞增殖活力明显弱于37℃培养条件下的腹腔肥大细胞(P0.05),并随时间的变化差异程度逐渐变大；腹腔肥大细胞在无外界刺激的情况下,35℃培养条件下的细胞p-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率明显高于37℃培养条件下的细胞；C48/80或IgE刺激后,35℃培养条件下的细胞p-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率明显升高,且升高程度显著高于37℃培养条件下的细胞。3.35℃和37℃培养条件下,RBL-2H3细胞增殖活力都大于腹腔肥大细胞；无外界刺激时,35℃和37℃的腹腔肥大细胞p-氨基己糖苷酶释放率都显著高于RBL-2H3细胞,但组胺释放率有波动；C48/80刺激后,腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶及组胺释放率都升高,细胞脱颗粒程度加剧,但RBL-2H3细胞升高幅度显著低于腹腔肥大细胞；IgE刺激后,肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率升高,且显著高于RBL-2H3细胞,肥大细胞组胺释放率也有升高,但35℃培养条件下高于RBL-2H3细胞,37℃培养条件下情况相反。结论：1.改良方法,建立大鼠腹腔肥大细胞原代培养体系。2.35℃培养条件下腹腔肥大细胞增殖活力明显弱于37℃培养条件下的腹腔肥大细胞,并随时间的变化差异程度逐渐变大；腹腔肥大细胞在35℃培养条件下脱颗粒程度高于37℃,更易受到外界刺激；3.相同培养温度条件下,RBL-2H3细胞增殖活力大于腹腔肥大细胞；针对不同刺激物,腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶和组胺释放率不同。4.腹腔肥大细胞与RBL-2H3细胞在两种培养温度条件下的活力和功能不同,不同刺激物的生物刺激效果不同,RBL-2H3细胞在体外研究中不能完全代替肥大细胞。本研究的特色与创新：1.确认了温度对于肥大细胞活力和功能的影响,为探究机体不同位置肥大细胞的致病机理提供一定理论依据。2.揭示了腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞在不同培养温度条件下存在差异。
【关键词】：腹腔肥大细胞 RBL-2H3细胞 C48/80 IgE 温度
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-14
• 一、前言14-17
• 二、材料与方法17-23
• 1. 仪器与试剂17-18
• 2、实验方法18-22
• 3、统计分析22-23
• 三、实验结果23-34
• 1. 大鼠腹腔肥大细胞的分离、培养与鉴定23-24
• 2. RBL-2H3细胞的培养及鉴定24-25
• 3. 不同温度对腹腔肥大细胞活力和功能的影响25-28
• 4. 不同温度下腹腔肥大细胞与RBL-2H3细胞活力和功能的差异28-32
• 5. 大鼠睾丸中肥大细胞的定位32-34
• 四、讨论34-36
• 五、全文总结36-37
• 六、参考文献37-40
• 文献综述40-56
• 参考文献49-56
• 硕士研究生期间发表的论文56-57
• 致谢57-58

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本文编号：562571