Robo2调控小鼠肾脏发育信号通路机制的研究

发布时间：2017-07-19 12:31

  本文关键词：Robo2调控小鼠肾脏发育信号通路机制的研究

  更多相关文章： Robo2 肾脏发育 信号分子 Aldh1a2

【摘要】：目的：肾脏发育缺陷可导致严重的泌尿系统结构缺陷以及功能异常。有研究发现Robo2异常表达可导致输尿管芽分支减少、肾小球数目减少、足细胞病变等缺陷,但其调控肾脏发育的信号机制并不清楚。本研究通过对比Robo2基因敲除和野生型小鼠胚肾信使R NA (mRNA)表达差异,筛选小鼠发育过程中与Robo2相互作用的蛋白,并验证筛选的蛋白与Robo2相互作用关系以及在肾脏发育过程中的作用,最终确定Robo2调控后肾间充质与输尿管芽发育的关键信号分子,明确其调控肾脏发育的信号分子作用途经。方法：(1)显微分离胚龄E14.5d的Robo2纯合子和野生型胚鼠肾脏,提取RNA,进行RNA-Seq测序,对比Robo2纯合子和野生型胚鼠肾脏中的mRNA差异,并选取差异显著的基因进行RT-PCR验证。(2)显微分离胚龄E13.5d的ICR胚鼠肾脏,提取蛋白,利用Robo2单克隆抗体进行免疫共沉淀后,收集蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,质谱分析并筛选与Robo2可能相互作用的蛋白。(3)验证筛选的视黄醛合成酶(Aldh1a2)与Robo2的相互作用：显微分离胚龄E12.5d、E13.5d、E14.5d、E15.5d、E16.5d、E17.5d、E18.5d胚鼠肾脏和出生后日龄P7d、P14d、P21d、P35d小鼠肾脏,冰冻切片进行免疫荧光染色观察Aldh1a2在小鼠肾脏发育各阶段的表达部位；提取蛋白进行Western Blot分析Aldhla2在小鼠肾脏发育各阶段的表达量的变化；孕鼠食用过量视黄酸后观察胚鼠肾脏的表型变化。结果：(1)通过对Robo2纯合子和野生型胚肾进行RNA-Seq测序分析,有20872个基因表达量存在差异,分析了Robo2-/-小鼠肾脏基因表达分布比率并绘制了Robo2在小鼠肾脏的可能分子信号网络,RT-PCR验证了胚肾野生型和纯合子相比,Klc1、Clta、Pomgnt1、Fhl1、Robo2、Abi1的表达量差异超过20倍。(2)质谱分析可能参与Robo2调控后肾间充质与输尿管芽发育的25种蛋白：Aldh1a2、Rob o1等。(3)肾脏发育过程中Aldh1a2的表达变化：①Western Blot结果显示,Aldh1a2在发育的E12.5d-E15.5d表达水平最高,随后水平明显下降,在出生后呈现低水平表达。②免疫荧光染色结果显示,Aldhla2在肾脏发育过程主要表达于后肾间充质基质细胞和少数帽状间充质细胞,而不在输尿管芽表达。随着胚龄增加及肾脏发育,在E14.5d后逐渐表达于肾小管前体细胞、逗号形体和“S”形体、早期的近端小管上皮细胞、肾小球包曼氏囊壁层上皮细胞以及肾小球系膜细胞。在出生后35天,肾脏发育成熟时Aldh1a2在上述部位消失。③孕鼠喂食视黄酸后胚肾和输尿管发育异常,肾脏体积减小,肾脏肾盂扩张,输尿管弯曲扩张畸形,输尿管与肾脏连接异常,输尿管与膀胱连接异常,还可出现“马蹄肾”畸形。结论：Robo2基因敲除后,Klc1、Clta、Pomgnt1、Fhl1及Abil等基因表达水平明显降低,提示Robo2对它们在肾脏发育过程中具有正调控作用,参与了Robo2的分子信号通路；质谱分析筛选出25种可能与Robo2相互作用的Aldhla2、Robo1等蛋白,从分布、表型等验证了Aldh1a2可能是其关键信号分子,孕鼠喂食过量视黄酸后导致胚鼠肾脏和输尿管扩张畸形。
【关键词】：Robo2 肾脏发育 信号分子 Aldh1a2
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R334.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-13
• 第1章 引言13-17
• 1.1 肾脏发育及其在泌尿系统疾病防治中的地位13-14
• 1.2 Robo2的分子结构以及Slit2/Robo2信号通路14-15
• 1.3 Robo2与肾脏发育的关系15-16
• 1.3.1 Robo2在肾脏的表达15
• 1.3.2 Robo2对肾脏发育的影响15-16
• 1.4 本课题的研究内容16-17
• 第2章 Robo2基因敲除和野生型小鼠胚肾mRNA差异17-32
• 2.1 实验材料、主要试剂和仪器17-18
• 2.1.1 实验动物17
• 2.1.2 实验试剂17
• 2.1.3 主要仪器17-18
• 2.1.4 其他18
• 2.2 实验方法18-24
• 2.2.1 实验动物处理及标本留取18
• 2.2.2 Robo2基因敲除小鼠的基因型鉴定18-20
• 2.2.3 RNA提取和cDNA合成20-21
• 2.2.4 RNA-Seq测序21-22
• 2.2.5 IPA软件分析Robo2信号网络22
• 2.2.6 实时定量RT-PCR检测22-24
• 2.2.7 统计学处理24
• 2.3 实验结果24-30
• 2.3.1 RNA-Seq测序结果24-25
• 2.3.2 IPA数据分析25-27
• 2.3.3 RT-PCR验证结果27-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-32
• 第3章 小鼠肾脏发育过程中与Robo2相互作用的蛋白32-43
• 3.1 实验材料、主要试剂和仪器设备32-33
• 3.1.1 实验动物32
• 3.1.2 实验试剂32-33
• 3.1.3 主要仪器33
• 3.1.4 其他33
• 3.2 实验方法33-37
• 3.2.1 免疫共沉淀33-34
• 3.2.2 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶电泳分离蛋白34-35
• 3.2.3 银染及脱色35-36
• 3.2.4 胶内酶解36-37
• 3.2.5 2D-LC/MS检测37
• 3.2.6 生物信息学分析37
• 3.3 实验结果37-41
• 3.3.1 与Robo2相互作用的蛋白质37-38
• 3.3.2 蛋白质的功能分析38-41
• 3.3.2.1 String9.05软件分析蛋白质38-40
• 3.3.2.2 IPA软件分析蛋白质40-41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 小结42-43
• 第4章 小鼠胚肾发育过程Robo2与Aldh1a2的相互关系43-65
• 4.1 实验材料、主要试剂和仪器设备43-45
• 4.1.1 实验动物43
• 4.1.2 实验试剂43-44
• 4.1.3 主要仪器44
• 4.1.4 其他44-45
• 4.2 实验方法45-48
• 4.2.1 构建视黄酸过量孕鼠模型45
• 4.2.2 冰冻组织留取及冰冻切片免疫荧光染色45-46
• 4.2.3 石蜡组织留取及石蜡HE染色46
• 4.2.4 Wtem Blot检测蛋白表达46-48
• 4.2.5 胚肾体外培养及免疫荧光染色48
• 4.2.6 统计学处理48
• 4.3 实验结果48-61
• 4.3.1 Robo2与Aldh1a2在胚肾的免疫荧光染色48-49
• 4.3.2 Aldh1a2在小鼠胚肾发育各阶段蛋白表达情况49-50
• 4.3.3 Aldh1a2在小鼠胚肾发育各阶段免疫荧光染色结果50-57
• 4.3.4 孕鼠喂食视黄酸后胚肾和输尿管发育异常57-61
• 4.4 讨论61-63
• 4.5 小结63-65
• 第5章 全文总结65-66
• 致谢66-67
• 参考文献67-70
• 附录实验所需主要试剂配制70-72
• 攻读学位期间的研究成果72-73
• 综述73-85
• 参考文献81-85

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 周昱;夏正坤;;肾脏发育与肾脏疾病的发生[J];发育医学电子杂志;2015年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 陈大鹏;miR-34a调控系膜增殖性肾炎的机制研究[D];南开大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 宋东建;小儿肾母细胞瘤中P73和SIX2基因的表达及甲基化相关性研究[D];郑州大学;2013年

2 周普辉;Nf1在肾脏发育过程中的作用及其机理[D];重庆医科大学;2014年

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本文编号：562954