重组人内皮抑素、转铁蛋白胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒初步研究

发布时间：2017-07-20 02:06

  本文关键词：重组人内皮抑素、转铁蛋白胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒初步研究

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【摘要】：内皮抑素作为已知的肿瘤血管生成抑制剂,可以用于实体肿瘤的治疗。目前临床上内皮抑素浓度的检测主要采用ELISA方法,但该方法耗时久且价格昂贵,我们希望能够找到其它有效的方法能够快速、方便地检测内皮抑素。免疫胶乳比浊法可自动化操作、重复性较好且可以减少非特异性凝集,假阳性率低。因此我们通过用重组人内皮抑素抗体标记合适粒径的胶乳,以合适的吸光度变化范围和较大的线性范围为标准对试剂组分、检测条件等进行调试,通过单因素实验确定了较佳的试剂组分浓度,检测重组人内皮抑素标准品,组成了自制胶乳增强免疫比浊法检测重组人内皮抑素试剂盒。结果表明,大小均一、直径为130 nm的胶乳与碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和内皮抑素抗体共价结合得到致敏胶乳。致敏胶乳的最佳浓度为0.3%,波长为510 nm条件下检测,PEG 6000用量为2.5%,样品加样量为8 μL,防腐剂选择0.05% NaN_3,R1试剂与样品反应5 min后加入致敏胶乳后37℃反应10 min进行检测,检测到的吸光度值变化范围大且区分度好。转铁蛋白在抗菌、杀菌以及肿瘤和癌症防治等方面有突出的作用。为了能够更方便地检测转铁蛋白浓度,希望能够研制出胶乳增强免疫比浊法检测转铁蛋白试剂盒。本研究以含转铁蛋白基因的质粒为模板用PCR方法扩增目的基因,用Xho ⅠNde Ⅰ分别对目的基因及表达载体pET28a进行双酶切获得目的片段和线性质粒。在T4连接酶作用下连接,构建成含转铁蛋白基因的表达载体,为转铁蛋白表达纯化、制备抗体及试剂盒的制备提供了条件。
【关键词】：内皮抑素 胶乳增强免疫比浊法 转铁蛋白 载体构建
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 中文摘要4-5
• 英文摘要5-10
• 第一章 综述10-27
• 1. 肿瘤血管靶向治疗的进展10-11
• 2. 内皮抑素的发现11-12
• 3. 内皮抑素的生物学结构12
• 4. 内皮抑素的分布12-13
• 5. 内皮抑素的生物学功能13-14
• 5.1 内皮抑素抑制内皮细胞增殖、迁移作用13
• 5.2 内皮抑素对新生血管生成的抑制作用13
• 5.3 内皮抑素对肿瘤的生长和转移的抑制作用,促进肿瘤细胞凋亡13-14
• 6. 内皮抑素的作用机制14-16
• 7. 内皮抑素存在的问题16-17
• 8. 恩度(endostar)17-19
• 9. 血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)19-21
• 参考文献21-27
• 第二章 人内皮抑素胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒27-44
• 1. 引言27
• 2. 材料和方法27-32
• 2.1 材料27-28
• 2.2 方法28-32
• 3. 结果与分析32-41
• 3.1 ELISA检测重组人内皮抑素抗体的标准曲线32
• 3.2 胶乳原液稀释标准曲线32-33
• 3.3 胶乳颗粒粒径的选择33-34
• 3.4 胶乳浓度的选择34-35
• 3.5 波长的选择35-37
• 3.6 不同加样量的比较37
• 3.7 不同反应时间的比较37-38
• 3.8 PEG6000与PEG2000的比较38
• 3.9 PEG6000浓度的选择38-39
• 3.10 NaN_3与PC 300的比较39
• 3.11 HITACHI 7060全自动生化分析仪检测39-40
• 3.12 胶乳增强免疫比浊法检测重组人内皮抑素试剂盒40
• 3.13 酵母表达的重组人内皮抑素浓度的检测40-41
• 4. 讨论41-43
• 参考文献43-44
• 第三章 转铁蛋白胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的初步研究44-58
• 1. 引言44
• 2. 材料、试剂和方法44-51
• 2.1 材料44
• 2.2 主要试剂44-45
• 2.3 主要仪器45
• 2.4 转铁蛋白表达质粒的构建45-51
• 3. 结果51-56
• 3.1 Tf基因PCR电泳结果51
• 3.2 pET28a质粒及TfPCR模板质粒电泳结果51-52
• 3.3 Tf基因PCR产物酶切、pET28a质粒酶切52
• 3.4 重组质粒的鉴定52-56
• 4. 讨论56-57
• 参考文献57-58
• 第四章 依诺沙星抗肿瘤新适应症研究58-69
• 1. 引言58-59
• 2. 材料方法59-65
• 2.1 材料59-60
• 2.2 细胞培养60
• 2.3 CCK-8检测依诺沙星对细胞活力的影响60-61
• 2.4 siRNA的转染61-62
• 2.5 细胞总RNA的提取62-63
• 2.6 逆转录PCR(RT-PCR)63
• 2.7 荧光定量PCR(qPCR)63-65
• 3. 结果65-67
• 3.1 CCK-8检测依诺沙星对BGC-803,HB2细胞活力的影响效果65-66
• 3.2 BGC-803细胞VEGF-mRNA、HB2细胞bcl-2-mRNA相对表达量66-67
• 4. 讨论67-68
• 参考文献68-69
• 附录69-70
• 致谢70-71

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