双功能酶SpoT调控幽门螺杆菌适应克拉霉素压力机制研究

发布时间：2017-07-20 18:26

  本文关键词：双功能酶SpoT调控幽门螺杆菌适应克拉霉素压力机制研究

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【摘要】：目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种具有极生鞭毛的革兰氏阴性菌,生存于人类胃黏膜表面,人类大多数在儿童早期即感染Hp,且终生携带。研究表明,Hp感染是胃炎胃溃疡发生发展的重要诱因,同时也是引起胃癌及胃黏膜相关组织淋巴瘤的关键危险因子。因此,1994年,Hp被世界卫生组织国际癌症研究机构列为Ⅰ级致癌原,因而Hp感染的治疗和根除成为亟需解决的科学问题。 Hp是否完全清除与根治,直接影响上述疾病的转归,目前临床上治疗多采用在胶体铋剂或质子泵抑制剂的基础上加两种抗生素的三联疗法,克拉霉素(Clarithromycin,CLR)是新一代的大环内酯类抗生素,因其易吸收,对胃酸稳定,因此是治疗幽门螺杆菌三联疗法常用的抗生素之一。最新的马特里共识已经将以CLR为首的三联疗法列为根除幽门螺杆菌的首选疗法。但是近年来由于CLR的过量和反复使用,Hp对CLR的耐药率国内外均呈上升趋势。目前对CLR耐药机制的研究主要集中在对Hp23s rRNA基因点突变的分析上。但近几年的研究发现,许多Hp耐药菌株的23s rRNA的基因并未发生突变,暗示23s rRNA突变并不是产生CLR耐药的唯一因素,耐药机制有待于进一步研究,以达到对CLR的合理使用。 SpoT,最早发现其功能为调控大肠杆菌的严谨应答。细菌在各种不利环境下发生的基因表达模式的改变统称为严谨应答。调控严谨应答的是一个小的信号分子,称作四磷酸鸟苷((p)ppGpp)。在不利环境下,大量积累的(p)ppGpp可以与RNA聚合酶结合从而改变启动子的特嚩性和转录效率进而影响参与细菌生存力及抗压相关基因的表达变化。在大肠杆菌中,(p)ppGpp是由RelA和SpoT两种酶调节产生的,而在幽门螺杆菌中仅含有SpoT,且为双功能酶,同时具有合成和水解(p)ppGpp的活性。有研究表明,(p)ppGpp参与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)对万古霉素的耐受调控过程,但(p)ppGpp是否参与Hp对CLR等抗生素的耐药调控尚未有文献报道。 研究表明,在革兰氏阴性菌中,外膜通透性的降低及主动外排泵的活化是膜蛋白参与耐药的主要贡献。我们通过基因芯片预测发现多种膜蛋白在CLR刺激下mRNA的表达水平有明显的变化,暗示膜蛋白在幽门螺杆菌抗CLR耐药过程中可能发挥着重要作用,但具体机制尚未有人研究。 本研究主要探讨Hp双功能酶SpoT及其产物(p)ppGpp在CLR压力环境下是否有调控作用；探索受SpoT调控的下游基因,为CLR耐受提供新的机制,为寻找新的药物靶点和CLR在临床的合理使用提供指导。 方法 1.同源重组法在Hp26695菌株中构建spoT缺失突变株("縮poT), kefB缺失突变株("縦efB)及spoT回复株(spoT*)。 2.琼脂稀释法判定CLR的最小抑菌浓度(MIC)。用含不同递减浓度CLR的平板接种受试菌,孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 3.检测双功能酶SpoT及其产物(p)ppGpp在CLR存在的压力环境下的表达变化。 (1)用最小抑菌浓度(MIC)的CLR刺激野生株Hp26695,对照组为同样培养的野生株Hp26695(不加CLR刺激),1h后,分别提取两组菌的RNA,并反转录为cDNA, Real-time PCR检测spoT的表达。 (2)将Hp26695,"縮poT及spoT*用32p标记一代后,用MIC的CLR分别处理野生株Hp26695,"縮poT及spoT*,对照组为同样培养的野生株Hp26695,"縮poT及spoT*(不加CLR处理),1h后,分别提取六组菌的核苷酸,薄层层析法检测(p)ppGpp合成量的变化。 4.平板菌落计数法、MIC测定以及荧光染色法比较Hp26695,"縮poT及spoT*经CLR处理后其生存率以及MIC的变化。 5.基因芯片比较Hp26695与"縮poT在CLR最小抑菌浓度下基因表达差异。将未经CLR刺激的野生株及"縮poT株以及经过CLR刺激1h后的野生株和"縮poT株分别做基因芯片检测,通过四组数据比较找出CLR压力下可能受SpoT调控的基因。 6Real-Time PCR法验证基因芯片结果。将Hp26695,"縮poT及spoT*分别用CLR处理,对照组为同样培养的三种菌(不加CLR处理),1h后,分别提取两组菌的RNA,并反转录为cDNA,运用Real-time PCR检测基因芯片筛选出的基因的表达。 7.检测受SpoT调控的基因缺失突变后Hp耐受CLR能力的影响。通过平板菌落计数法、MIC测定以及荧光染色法比较野生株与缺失突变株经CLR处理后生存率及MIC的变化。 结果 1.在野生株Hp26695上成功构建出spoT缺失突变株("縮poT), kefB缺失突变株("縦efB)以及在"縮poT中构建出spoT回复株(spoT*)。 2.CLR能够引起Hp的严谨应答,SpoT及其产物(p)ppGpp参与Hp耐受CLR的调控过程。用0.125μg/mL的CLR处理Hp266951h后,与对照组相比,在mRNA水平,处理组基因spoT的表达显著升高(P＜0.05)；用32p标记的Hp26695株,"縮poT株及spoT*株经0.125μg/mL的CLR处理后发现,与对照组相比,Hp26695株及spoT*株的(p)ppGpp的合成量均有明显的增高,而对于"縮poT株,处理前后未见(p)ppGpp合成。 3SpoT在耐受CLR过程中确实发挥重要作用。为进一步证明SpoT参与Hp耐受CLR的调控过程,我们通过平板菌落计数法、MIC测定以及荧光染色的方法比较Hp26695,"縮poT及spoT*经CLR处理以后其生存率以及MIC的变化发现,用5MIC的CLR分别处理三种菌,"縮poT的生存率在处理2h时即降到1%以下,而Hp26695及spoT*在处理8h后其生存率仍在10%以上；荧光染色结果显示,5MIC的CLR处理后,"縮poT的存活率较野生株及回复株明显降低；同样,通过对三种菌株的MIC检测发现,"縮poT的MIC较野生株及回复株降低了50%左右。 4.多种膜蛋白参与Hp适应CLR压力过程。将未经CLR刺激的野生株Hp26695和"縮poT株以及经过CLR刺激1h后的野生株不(?)"縮poT的基因芯片结果比较得出,在0.125μg/mL的CLR的刺激下,野生株Hp26695中约有221个基因表达发生显著的变化(Fold≥3),其中占比例最高的是膜蛋白,占24%,在膜蛋白基因中有13个基因在野生株Hp26695上有显著变化,而在"縮poT菌株中CLR处理前后基因的表达无显著变化。 5.受SpoT调控的质子泵KefB参与Hp适应CLR过程。用Real-Time PCR的方法验证芯片预测可能受SpoT调控的基因,发现只有质子泵基因kefB在Hp26695经CLR处理后表达量明显上调(P＜0.05),而在将spoT敲除的菌株中,经CLR处理前后kefB表达量无明显变化,将spoT基因回复以后,kefB的表达量又有显著上调(P＜0.05)。 6KefB参与Hp耐受CLR过程。为进一步证明质子泵KefB参与Hp适应CLR过程,我们构建了kefB缺失突变株并通过平板菌落计数法、MIC测定以及荧光染色法比较Hp26695,"縦efB经CLR处理后生存率以及MIC的变化。发现,用5MIC的CLR分别处理两种菌,"縦efB在处理4h后存活率即降到1%以下,而Hp26695与前面结果一致,处理8h后其存活率仍在10%以上；荧光染色结果显示,5MIC的CLR处理后,"縦efB的存活率较野生株明显降低；同样,通过对两种菌株的MIC检测发现,"縦efB的MIC较野生株下降了25%。 结论 双功能酶SpoT及其产物(p)ppGpp在Hp适应CLR过程中发挥重要的调控作用,能够调控下游质子泵KefB的高表达,使得细菌抵抗抗生素CLR的损害,最终使得Hp快速适应CLR环境,为进一步耐受应答、耐药株产生奠定了时间基础和物质基础。
【关键词】：幽门螺杆菌 克拉霉素 SpoT (p)ppGpp KefB
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符号说明15-17
• 前言17-20
• 材料与方法20-37
• 1. 实验材料20-26
• 2. 实验方法26-37
• 实验结果37-40
• 讨论40-44
• 结论44-45
• 本研究未完成工作45-46
• 附图表46-62
• 参考文献62-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间发表的论文68-69
• 附件69

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