小分子抑制剂与Mcl-1蛋白作用模式及分子优化的研究

发布时间：2017-07-27 16:10

  本文关键词：小分子抑制剂与Mcl-1蛋白作用模式及分子优化的研究

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【摘要】：Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,二者通过BH3沟槽发生的相互作用来决定细胞是否凋亡。研究发现多种肿瘤细胞的抗凋亡蛋白例如Mcl-1与Bcl-2蛋白的过量表达,使细胞逃避凋亡,获得永生。因此抗凋亡蛋白是抗癌药物研发的重要靶点。靶向Bcl-2抗凋亡蛋白的小分子抑制剂可以通过与抗凋亡蛋白的BH3沟槽结合,释放出促凋亡蛋白,导致癌细胞的凋亡。Mcl-1和Bcl-2是抗凋亡蛋白的两个典型代表,同时结合Bc1-2与Mcl-1蛋白,并拮抗两个蛋白的功能,是靶向Bcl-2家族小分子抑制剂的发展方向。由于Mcl-1的BH3沟槽与Bcl-2蛋白有一些差异,因此现有的Bcl-2小分子抑制剂多数不能同时与Mcl-1蛋白结合,通过研究小分子抑制剂与Mcl-1蛋白的结合模式,可以获得Mcl-1蛋白BH3沟槽的特征性结构信息,指导Mcl-1抑制剂或者Mcl-1/Bcl-2双抑制剂的分子设计,获得亲和力更好的抗癌先导分子。 首先我们构建了Mcl-1蛋白的表达质粒。通过优化蛋白表达的诱导条件,15N标记的Mcl-1蛋白的表达量达到7.9mg/L,与未标记Mcl-1蛋白的表达量(8.3mg/L)相仿。通过镍柱亲和层析洗脱条件的优化与分子筛层析,将蛋白的纯度提高到了95%以上。圆二色谱结果显示纯化所得Mcl-1蛋白具有正确折叠的二级结构。同时蛋白NMR一维图谱和二维图谱结果显示,15N标记的Mcl-1蛋白的谱峰分散良好,表明其高级结构正确,纯化后的蛋白活性良好,满足后续的二维核磁实验的要求。 接着对本课题组设计合成的小分子C1(2,3-dihydroxyanthracene-9,10-dione)进行分子对接实验,获得了Mcl-1蛋白中与C1的结合模式,发现C1与R263形成了氢键,C1的蒽醌骨架横跨R263到p3口袋。然而,骨架末端的苯环指向Mcl-1蛋白的p3口袋但并未占据p3口袋。继续设计了小分子C2(6-bromo-2,3-dihydroxyanthracene-9,10-dione),以占据Mcl-1蛋白的p3口袋。荧光偏振实验测得C2对Bcl-2以及Mcl-1蛋白Ki值分别为132nM和107nM,和C1亲和力相比分别提高了三倍和四倍。1H-15N HSQC二维核磁结果表明C2结合于Mcl-1蛋白表面的BH3结合沟槽从,其中R263残基的化学位移最大。C2的溴原子与Mcl-1蛋白p3口袋的F228残基相互作用,分子对接实验也直观的证明了C2的溴原子占据了Mcl-1的p3口袋。随后,在C2的基础上设计了C3、C4、C5、C6,用硫原子替换溴原子,并在硫原子上接上较长的取代基,以占据Mcl-1蛋白的p2口袋。荧光偏振实验表明这四个小分子对Mcl-1蛋白和Bcl-2蛋白的亲和力比C2均有明显提升,特别是C6小分子(dihydroxy-6-((4-isopropylphenyl)thio)anthracene-9,10-dione),其对Bcl-2和Mcl-1的Ki值分别是24nM和13nM。与C1相比,分别提高了约13倍和38倍。HSQC实验表明,除了在C2中发生化学位移的氨基酸,C6滴定Mcl-1蛋白新增的化学位移氨基酸残基包括Mcl-1蛋白p2口袋的M250和F270,证明了C6达到了与Mcl-1蛋白的p2口袋相互作用的目的。HSQC辅助分子对接的方法指导设计了高亲和力的Bcl-2/Mcl-1双抑制剂C6。
【关键词】：~1H-~(15)N HSQC二维核磁 小分子抑制剂 Mcl-1 结合模式 分子对接
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文献综述10-21
• 1.1 引言10
• 1.2 细胞凋亡与Bcl-2家族10-15
• 1.2.1 细胞凋亡10-12
• 1.2.2 Bcl-2家族12-15
• 1.3 Bcl-2家族的重要成员——Mcl-1蛋白15-17
• 1.3.1 Mcl-1蛋白的发现和特征15-16
• 1.3.2 Mcl-1蛋白的生理学功能16-17
• 1.4 靶向Bcl-2家族蛋白的抑制剂的研究进展17-20
• 1.4.1 ABT-73717-18
• 1.4.2 ABT-26318
• 1.4.3 Obatoclax18
• 1.4.4 TW-3718-19
• 1.4.5 HA 14-119
• 1.4.6 Apogossypolone(ApoG2)19
• 1.4.7 Gossypol19-20
• 1.4.8 白屈菜赤碱20
• 1.5 选题指导思想与研究目的20-21
• 2 Mcl-1蛋白表达的优化21-47
• 2.1 引言21
• 2.2 实验材料和试剂21-25
• 2.2.1 菌株与载体21-22
• 2.2.2 细菌培养基22-23
• 2.2.3 其它常用试剂配方23-24
• 2.2.4 实验仪器24-25
• 2.3 实验方法25-34
• 2.3.1 重组Mcl-1蛋白的基因克隆25-27
• 2.3.2 感受态细胞的制备及转化27-28
• 2.3.3 未标记Mcl-1蛋白的表达与纯化28-29
• 2.3.4 ~(15)N标记的Mcl-1蛋白的诱导表达29
• 2.3.5 Mcl-1蛋白的纯化29-30
• 2.3.6 目的蛋白的分子筛层析30
• 2.3.7 蛋白定量(考马斯亮蓝法)30-31
• 2.3.8 Western Blot31-32
• 2.3.9 圆二色谱32-33
• 2.3.10 测定Mcl-1蛋白核磁图谱33-34
• 2.4 结果和讨论34-46
• 2.4.1 基因的克隆结果分析34-35
• 2.4.2 目的蛋白的表达与结果分析35-42
• 2.4.3 Mcl-1蛋白的定量42-43
• 2.4.4 Mcl-1蛋白的定性分析43-46
• 2.5 本章小结46-47
• 3 BH3 mimetics与Mcl-1蛋白的结合模式与分子优化的研究47-62
• 3.1 引言47
• 3.2 实验部分47-49
• 3.2.1 荧光偏振47-48
• 3.2.2 分子对接48-49
• 3.2.3 ~1H-~(15)N HSQC二维核磁49
• 3.3 结果分析49-60
• 3.3.1 C1与Mcl-1蛋白作用模式的研究49-50
• 3.3.2 基于二维核磁指导的小分子抑制剂的优化50-60
• 3.4 本章小结60-62
• 结论62-63
• 参考文献63-70
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况70-71
• 致谢71-72

【参考文献】

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1 林克江,尤启冬,林东海,吴梧桐,叶波平;药物设计中的生物核磁共振技术[J];中国药科大学学报;2004年05期

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本文编号：582245