UL27、UL54基因shRNA联合干扰HSV-2复制研究

发布时间：2017-07-29 12:13

  本文关键词：UL27、UL54基因shRNA联合干扰HSV-2复制研究

  更多相关文章： RNA干扰 短发夹RNA Ⅱ型单纯疱疹病毒 UL27基因 UL54基因

【摘要】：目的：研究Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type2, HSV-2) UL27、 UL54基因的重组表达载体shRNA (small hairpin RNA, shRNA)的干扰作用,并探讨二者联合干扰对HSV-2复制的影响。 方法：构建的UL54、 UL27基因的shRNA表达载体,通过脂质体介导重组表达载体转染HEK293细胞,采用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测转染效率,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,通过shRNA重组表达载体和转染试剂lipofectamine2000不同剂量比例对转染效率的优化,找出转染效率较高且细胞毒性较低的shRNA重组表达载体与lipofectamine2000的最佳配比。shRNA重组表达载体转染HEK293细胞后接种HSV-2。采用实时荧光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative PCR)检测HSV-2UL27、UL54mRNA的表达水平,终点滴定法检测细胞上清液中的病毒滴度,MTT比色法检测细胞存活率,蛋白印迹法(Western blot)检测相应功能蛋白的表达情况,确定UL27、UL54不同靶基因的干扰效率,筛选出UL27、UL54单干扰效率较高的shRNA重组表达载体,并进行联合干扰实验,观察联合干扰对HSV-2复制的影响。 结果：(1)根据转染效率以及细胞存活率测定结果,筛选出质粒与转染试剂复合物的最佳配比为0.8μg:2μl。(2)实时荧光定量PCR结果显示,UL27、UL54各单干扰组均能不同程度的抑制目的基因mRNA的表达,其中UL27shRNA75组和UL27shRNA2265组对UL27mRNA表达抑制率分别为75.17%、60.22%, UL54shRNA1081组、UL54shRNA1407组对UL54mRNA表达抑制率分别为69.61%、51.46%,与空白对照组相比均具有显著性差异(P0.05)；联合干扰UL27shRNA75+UL54shRNA1081组对目的基因mRNA表达有明显的降低,抑制效果最佳,对UL27基因mRNA表达抑制率约为88.10%,对UL54基因mRNA表达降低,抑制率约为85.53%,与对照组和单干扰组比较都具有显著性差异(P0.05)。(3)终点滴定法结果显示：各干扰组可不同程度降低上清液中的子代病毒感染滴度,其中联合干扰UL27shRNA75+UL54shRNA1081组降低病毒滴度最明显,与空白组比较差异性显著(P0.01)。(4) MTT法检测结果显示,与阴性对照组相比,单干扰组和联合干扰组可不同程度提高细胞存活率,其中UL27shRNA75+UL54shRNA1081、UL27shRNA75+UL54shRNA1407组细胞存活率明显提高,分别为97.3+0.91%、95.7+1.14%,差异有显著意义(P0.05)。(5) Western blot检测目的基因蛋白,单干扰组与联合干扰组可不同程度降低靶基因蛋白的表达,其中UL27shRNA75+UL54shRNA1081联合干扰组能显著抑制相应的蛋白表达水平,蛋白表达量明显减少,与单干扰组相比具有显著差异(P0.05)。 结论：构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL54重组表达载体,均能在细胞水平上不同程度的干扰HSV-2UL27. UL54基因mRNA的表达,采用UL27、UL54基因联合具有更高的干扰效率,能更好的抑制HSV-2在HEK293细胞中复制。
【关键词】：RNA干扰 短发夹RNA Ⅱ型单纯疱疹病毒 UL27基因 UL54基因
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 英文缩略词表3-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 1 材料与方法13-16
• 2 实歐方法16-27
• 3 结果27-39
• 4 讨论39-44
• 5 展望44-45
• 6 结论45-46
• 参考文献46-49
• 综述：RNAi对HSV-2治疗的进展及影响49-59
• 参考文献56-59
• 致谢59-60
• 作者简历60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 孙乐栋,周再高,曾抗,贺凤姣,江丽芬,黄良,王宗发;性乱人群中单纯疱疹2型病毒感染情况及丽珠威的疗效观察[J];第一军医大学学报;2001年10期

2 周建勋,孟红;单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)包膜糖蛋白gG-2相关研究进展[J];国外医学.病毒学分册;2004年04期

3 冯海;张浩;屠静;罗凌琪;周琦;彭宜红;;敲减单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)UL30蛋白表达可抑制HSV-2复制[J];中国生物化学与分子生物学报;2007年12期

4 屠静;张浩;周琦;王波;曹眸;黄海;彭宜红;;细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用[J];中国生物化学与分子生物学报;2008年09期

5 周琦;张浩;王波;彭宜红;屠静;朱萌;徐萍;;下调细胞P21~(WAF1/CIP1)基因表达可抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型复制[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年04期

6 伊正君,朱道银;RNA干扰作用的机制及应用[J];生物学通报;2003年05期

7 陈保平,陈道平,林雨霖,周峰,张尉英,刘军,陈敏诲;HSV-2阴道感染并诱导小鼠阴道粘膜上皮细胞凋亡[J];中国病毒学;2002年01期

8 孙朝晖;杨慧兰;石玉玲;冼江;危敏;;HSV-2潜伏感染激活人神经母细胞瘤细胞中siRNA对LAT ORF的抑制作用[J];中国皮肤性病学杂志;2009年12期

9 罗凌琪;屠静;冯海;张浩;彭宜红;;细胞ERK信号通路对单纯疱疹病毒Ⅱ型增殖复制的影响[J];中华微生物学和免疫学杂志;2007年09期

，

本文编号：589115