蜂毒肽与基因变构IL-2融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性研究

发布时间：2017-07-29 18:18

  本文关键词：蜂毒肽与基因变构IL-2融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性研究

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【摘要】：目的构建融合基因蜂毒肽(melittin)与人变构白介素2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化毕赤酵母菌GS115。筛选多拷贝阳性菌株,甲醇诱导多拷贝阳性菌株表达融合蛋白,分离纯化该融合蛋白,并进行抗菌及抗肿瘤生物学活性研究。 方法以质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala)为模板,PCR获得目的基因,构建重组载体pPICZa A/M-IL-2(88Arg,125Ala);通过电转法转化毕赤酵母GS115; MMH,MDH筛选Mut+表型阳性菌株GS115; ZeocinTM梯度法及荧光定量PCR法筛选多拷贝转化酵母菌株。阳性转化子经甲醇持续诱导表达,提取上清,SDS-PAGE及BCA法检测最佳诱导时间,Western blot鉴定抗原性及特异性。经硫酸铵分级沉淀法、透析法、镍离子亲和层析纯化融合蛋白；液相测定法研究融合蛋白抑菌活性,CCK-8法检测该融合蛋白抗肿瘤活性。 结果成功构建毕赤酵母阳性转化菌株GS115/M-IL-2(88Arg,'25Ala).经MDH及MMH筛选出Mut+型重组菌株GS115/M-IL-2(88Arg,125Ala)。ZeocinTM梯度法及荧光定量PCR法成功筛选出两株多拷贝转化酵母菌株。SDS-PAGE检测在26kDa左右有明显目的条带,与理论值相符。BCA法测定甲醇诱导120h融合蛋白表达量达到最高浓度814.5mg/L,远远高于该融合蛋白在原核系统中产量。Western blot鉴定该融合蛋白具有抗原特异性。经硫酸铵分级沉淀法、透析法、镍离子亲和层析法获得纯度为99%的目的蛋白,经浓缩管浓缩获得浓度为432.5mg/L的目的蛋白5mL。经检测纯化的融合蛋白具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长活性,具有较强抑制人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela的生长增殖的生物活性。 结论成功构建毕赤酵母分泌表达重组载体pPICZa A/M-IL-2(88Arg,125Ala),筛选出可以稳定高表达的多拷贝重组菌株,表达产物经纯化,获得具有抑菌活性,抗肿瘤活性的高纯度融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)。为进一步研究制备低毒、高效的新型抗肿瘤药物奠定基础。
【关键词】：M-IL-2(~(88)Arg ~(125)Ala) 毕赤酵母 表达 纯化 生物活性
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-10
• 第一章 材料与仪器10-17
• 1.1 细胞10
• 1.2 质粒和菌株10
• 1.3 主要实验试剂及配制方法10-15
• 1.3.1 主要实验试剂10-11
• 1.3.2 主要试剂配制方法11-15
• 1.4 实验仪器和设备15-17
• 第二章 实验方法17-30
• 2.1 重组质粒的构建17-18
• 2.1.1 引物设计与合成17
• 2.1.2 目的基因扩增及载体构建17-18
• 2.2 重组质粒扩增18-19
• 2.2.1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5α18-19
• 2.3 电击转化毕赤酵母菌株GS115及阳性菌株筛选19-20
• 2.4 毕赤酵母GS115重组子鉴定20-21
• 2.4.1 毕赤酵母全基因的提取20-21
• 2.4.2 PCR鉴定重组子21
• 2.5 阳性菌株Mut表型鉴定21
• 2.6 多拷贝阳性菌株的筛选与鉴定21-22
• 2.7 诱导表达目的蛋白22
• 2.8 TCA沉淀、SDS-PAGE检测表达产物22-24
• 2.8.1 TCA法沉淀蛋白22-23
• 2.8.2 SDS-PAGE检测表达产物23-24
• 2.9 Western blot鉴定目的蛋白24-25
• 2.10 目的蛋白的纯化25-27
• 2.11 融合蛋白的生物活性检测27-30
• 2.11.1 融合蛋白的抑菌活性检测27-28
• 2.11.2 融合蛋白对人卵巢癌细胞生长增殖作用28-29
• 2.11.3 融合蛋白对Hela细胞生长增殖的作用29-30
• 第三章 实验结果30-41
• 3.1 重组质粒的构建及鉴定30-33
• 3.1.1 目的基因获取30-32
• 3.1.2 重组质粒构建及鉴定32-33
• 3.2 重组酵母菌株的筛选及鉴定33-34
• 3.3 重组酵母菌株mut表型鉴定34-35
• 3.4 多拷贝菌株筛选及鉴定35-36
• 3.5 阳性菌株诱导表达产物的检测及鉴定36-37
• 3.6 融合蛋白纯化结果37-38
• 3.7 融合蛋白生物活性检测38-41
• 3.7.1 融合蛋白抑菌活性检测38-39
• 3.7.2 融合蛋白对卵巢癌细胞SKOV3生长增殖作用检测39-40
• 3.7.3 融合蛋白对人宫颈癌Hela细胞生长增殖作用检测40-41
• 第四章 讨论41-44
• 4.1 毕赤酵母表达系统的探讨41
• 4.2 融合蛋M-IL-2(88Arg,125Ala)在毕赤酵母中表达效果探讨41-42
• 4.3 融合蛋白质纯化方法的探讨42-43
• 4.4 融合蛋白的生物活性探讨43-44
• 第五章 结论44-45
• 参考文献45-49
• 文献综述49-61
• 参考文献58-61
• 攻读学位期间研究成果61-62
• 致谢62-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孟林;刘明军;王斌;钱冬萌;;~(88)Arg IL-2的克隆构建及原核表达[J];青岛大学医学院学报;2006年04期

2 陈Z，

本文编号：590474