泛素特异性蛋白酶USP26分子克隆及活性检测

发布时间：2017-07-30 09:06

  本文关键词：泛素特异性蛋白酶USP26分子克隆及活性检测

  更多相关文章： 泛素特异性蛋白酶 USP26 定点突变 去泛素酶活性 男性不育

【摘要】：目的：泛素-蛋白酶体途径通过蛋白质的泛素化修饰，即泛素与靶蛋白氨基酸残基的结合来参与调节细胞细胞周期，膜蛋白转运，转录调控，组蛋白功能，免疫应答以及DNA复制和修复等多种重要进程。它对维持细胞正常的生命活动是非常重要的。然而这种蛋白修饰又是一种泛素化与去泛素化可逆、动态的过程。去泛素化酶通过负向调节蛋白的泛素化，在泛素介导的细胞过程中发挥重要作用。去泛素化酶（DUBs）功能失调可导致多种疾病，包括遗传性肿瘤和神经退行性疾病等。 去泛素化酶（DUBs）多属于半胱氨酸水解酶，又可分为四个亚型：泛素特异性蛋白酶家族（USPs）、泛素C-末端水解酶家族UCH、含OTU结构域的半胱氨酸水解酶（OTU家族）以及Machado-Joseph病结构域蛋白酶（MJD家族）。UBP家族成员众多，并且含有Cys，His和Asp/Asn等高度保守的结构域。本文研究的去泛素化酶USP26就是USP家族中的一种。 本课题研究的泛素特异性蛋白酶26（USP26）属于USPs超家族成员之一。有关USP26基因多态性与男性不育的关系还仅仅限于人群基因分型研究，但是受到人种、地域以及样本量等因素的影响，这些SNP是否与男性不育相关联还不是很清楚。本研究通过克隆人的USP26基因，并构建野生型USP26以及6种SNP的表达质粒，同时建立两种去泛素化酶活性检测体系，分析这些SNP是否对去泛素化酶活性产生影响，从而验证USP26基因是否引起男性不育，为后续的进一步研究提供理论支撑。 方法： （1）应用分子克隆技术克隆USP26基因。采用DNA提取试剂盒从血液中提取正常人基因组DNA，采用分段扩增的方法，运用聚合酶链式反应（PCR）分别扩增出usp26-5′和usp26-3′。然后将基因片段usp26-5′和usp26-3′分别克隆到pGEM-T easy载体上，采用蓝白斑筛选实验确定阳性克隆并通过碱裂解法提取质粒，经双酶切鉴定正确后再测序分析。将测序正确的pGEM-T-usp26-5′和pGEM-T-usp26-3′重组质粒以pGEX-6p-1质粒为媒介，最终得到重组质粒pGEX-6p-1-usp26。 （2）GST-USP26融合蛋白的表达及可溶性鉴定将重组质粒pGEX-6p-1-usp26转化到在大肠杆菌DH5α中并通过IPTG诱导表达，获得130kDa左右的GST-USP26融合蛋白，同时检测GST-USP26融合蛋白的可溶性。 （3）以重组质粒pGEX-6p-1-usp26-WT为模版，采用定点突变的方法构建这6种SNP（G170R、E192E、F348L、T659M、K734N、E749D）的重组质粒以及C304S突变型质粒。然后通过限制性内切酶更换载体pACT7，从而又得到以pACT7为载体的重组质粒，为后面的活性分析做准备。 （4）构建两种去泛素化酶活性检测体系，检测人野生型USP26、6种SNP以及C304S突变型去泛素化酶活性。①T7-USP/GST-Ub52方法将以pAC-T7为载体的重组质粒，野生型USP26-WT、6种SNP、C403S（无活性对照）、USP46（阳性对照）以及pAC-T7质粒（阴性对照）分别与pGEX-Ub52重组质粒共表达。其中pGEX-Ub52重组质粒表达的GST-Ub52作为模型底物。经过GSH-Sepharose-TM Resin纯化蛋白系统纯化GST融合蛋白，然后进行10%SDS-PAGE电泳检测。可将45kDa底物蛋白切断生成36kDa蛋白产物，即为去泛素化酶活性阳性，否则为阴性，而且通过两者的比例判断活性的大小。②GST-USP/Ub-Met-β-gal方法将以pGEX-6p-1为载体的重组质粒，野生型USP26-WT、6种SNP、C403S（无活性对照）、USP46（阳性对照）以及pGEX-6p-1质粒（阴性对照）分别与pAC-ub-β-gal重组质粒共表达。其中pAC-ub-β-gal重组质粒表达的Ub-Met-β-gal为模型底物。用小鼠抗β-gal单克隆抗体检测底物Ub-Met-β-gal的表达情况，应用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行分析。Ub-Met-β-gal底物蛋白被切断成低分子量的Met-β-gal蛋白，即去泛素化酶活性阳性，两者比例判断活性大小。 结果： （1）从人血液中克隆出泛素特异性蛋白酶USP26编码基因，全长2742bp。 （2）构建出USP266种SNP重组质粒pGEX-usp26-G170R、pGEX-usp26-E192E、 pGEX-usp26-F348L、 pGEX-usp26-T659M、 pGEX-usp26-K734N、pGEX-usp26-E749D以及无活性突变质粒pGEX-usp26-C304S。经酶切鉴定及测序验证均正确。 （3）表达出分子量约为130kDa的GST-USP26融合蛋白，，与USP26（分子量约为104kDa）和GST（分子量为26kDa）的理论分子量相符，并且在15℃、37℃分别经IPTG诱导4小时此融合蛋白均不溶。 （4）两种去泛素化酶活性检测方法得到一致的结果pGEX-6P-1质粒（阴性对照）与C304S突变无活性，而USP46（阳性对照）有一定活性，6种SNP活性均与野生型USP26相似，且都较强于USP46。图像上显示为质粒pGEX-6p-1以及C304S不能将45kDa的GST-Ub52切断成36kDa的产物，其余6种SNP以及野生型USP26均将GST-Ub52完全切成36kDa的产物，而USP46可将GST-Ub52部分切成36kDa的产物；而令一种检测体系，质粒pAC-T7以及C304S有两条带，最上面为底物Ub-Met-β-gal，最下面为内源性β-gal蛋白。USP46有三条带，不仅有上面的两条带，还有中间的底物Ub-Met-β-gal被去泛素化的产物Met-β-gal。6种SNP均有中间和下面的两条带。 结论： 1、成功克隆出人泛素特异性蛋白酶USP26基因。 2、USP26基因编码序列为2742bp，编码913个氨基酸，推测分子量为104kDa，而GST分子量为26kDa，所以130kDa处条带为GST-USP26融合蛋白并且检测其不可溶。 3、成功构建了USP266种SNP （G170R、 E192E、 F348L、T659M、K734N、E749D）以及C304S突变表达质粒。 4、建立了两种去泛素化酶活性检测方法，但这6种SNP活性均有受到影响，活性依然很强。
【关键词】：泛素特异性蛋白酶 USP26 定点突变 去泛素酶活性 男性不育
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R698.2;R3416
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-25
• 结果25-30
• 附图30-46
• 讨论46-48
• 结论48
• 参考文献48-53
• 综述 泛素特异性蛋白酶 USP26 与男性不育53-61
• 参考文献57-61
• 致谢61-62
• 个人简历62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 史轶超;魏莉;崔英霞;黄宇烽;;性染色体与男性不育[J];中华男科学杂志;2010年05期

2 张洁;邵小光;史艳彬;鄢磊;王磊;田宏;邱曙东;;泛素特异蛋白酶26基因多态性与特发性男性不育症的相关性研究[J];中华男科学杂志;2012年02期

本文编号：593419