鳗弧菌减毒活疫苗和载体疫苗候选株的开发

发布时间：2017-08-01 12:04

  本文关键词：鳗弧菌减毒活疫苗和载体疫苗候选株的开发

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【摘要】：减毒活疫苗具有给药方便、所需剂量低、可诱发较强免疫反应等优点,成为疫苗中的优选类型。目前利用基因工程手段开发的减毒活疫苗,虽然减毒效果显著,但其侵染宿主及在宿主内繁殖的能力被减弱,使其免疫效果受到影响。本课题选取铁调控启动子Pviua为体内诱导型启动子,分别控制不同噬菌体裂解基因的表达,包括来源于大肠杆菌噬菌体PhiX174的裂解基因E、来源于λ噬菌体的裂解基因S-R-Rz以及来源于沙门氏菌噬菌体P22的裂解基因13-19-15,从而在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)中筛选建立了高效的体内诱导型裂解系统Pviua-13-19-15。含有该系统的重组鳗弧菌在体外富铁培养基中正常生长,并具有天然的侵染能力。当重组鳗弧菌进入鱼体后,响应体内的低铁信号,开启噬菌体裂解基因的表达,使鳗弧菌快速裂解死亡。上述策略保证了鳗弧菌在侵入宿主的过程保持了天然毒株的侵染能力,进入鱼体后通过细菌裂解达到减毒的目的。将该系统导入鳗弧菌MVM425,得到候选疫苗株425/pUTP22。将该候选疫苗株在斑马鱼中进行了毒力和免疫效力评价,结果表明：该疫苗株与野生株相比,减毒效果明显,且注射和浸泡免疫的相对免疫保护率均超过80%,具有较好的应用价值。 细菌载体疫苗通常是指在减毒活菌中进行异源抗原的表达,从而实现一苗多价的目的。细菌载体疫苗因不需佐剂、强免疫原性、可携带不同抗原及类似病原菌的侵染力等特性,广泛应用于疫苗的开发。载体疫苗通常采用以质粒为载体的抗原表达模式,此模式存在质粒遗传不稳定、残留抗性标记、抗原过度表达导致细菌代谢负担等问题。为了解决上述问题,我们在鳗弧菌、大肠杆菌(Escherichia coli)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)中建立了无抗生素标记的Tn7转座系统,并利用Tn7转座子系统将来源于嗜水气单胞菌抗原基因gapA的表达结构整合到了鳗弧菌减毒活疫苗MVAV6203株的染色体上,实现了异源抗原在减毒鳗弧菌中的稳定表达。同时将已构建的体内裂解系统Rviua-13-19-15导入减毒鳗弧菌中,以实现减毒菌株的体内裂解,有利于增强鳗弧菌载体疫苗的安全性和抗原释放效果。
【关键词】：鳗弧菌 限铁调控 细菌裂解 减毒活疫苗 Tn7转座子 载体疫苗
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 综述与导言11-23
• 1.1 海水鱼类养殖11-13
• 1.1.1 鳗弧菌11-12
• 1.1.2 水产养殖中的疾病控制12-13
• 1.2 减毒活疫苗和载体疫苗13-15
• 1.2.1 减毒活疫苗13-14
• 1.2.2 载体疫苗14-15
• 1.3 Tn7转座子15-19
• 1.3.1 Tn7转座子15-16
• 1.3.2 Tn7转座子所需要的元件16
• 1.3.3 Tn7转座子所需要的酶16-17
• 1.3.4 Tn7转座所需要的工具17
• 1.3.5 Tn7转座子的应用17-19
• 1.4 位点特异性重组系统19-20
• 1.5 裂解基因20-22
• 1.6 本论文的主要内容和意义22-23
• 第2章 不同噬菌体的裂解基因的筛选23-40
• 2.1 引言23
• 2.2 实验用的材料23-26
• 2.2.1 菌株和质粒23
• 2.2.2 药品、试剂和仪器23-24
• 2.2.3 PCR引物24
• 2.2.4 培养基和试剂24-26
• 2.3 实验方法26-31
• 2.3.1 细菌培养及菌种保藏26
• 2.3.2 细菌质粒的提取26
• 2.3.3 DNA的酶切26-27
• 2.3.4 DNA的连接27
• 2.3.5 DNA琼脂糖凝胶电泳27
• 2.3.6 DNA的回收27
• 2.3.7 PCR实验27-28
• 2.3.8 大肠杆菌钙转感受态的制备(钙转法)28-29
• 2.3.9 大肠杆菌钙转化法29
• 2.3.10 鳗弧菌电击转化感受态的制备29-30
• 2.3.11 鳗弧菌的电击转化30
• 2.3.12 扫描电子显微镜(SEM)样品的制备30-31
• 2.4 结果与讨论31-39
• 2.4.1 不同裂解基因的克隆及裂解质粒的构建31-34
• 2.4.2 带不同裂解质粒大肠杆菌的裂解效果的测定34-36
• 2.4.3 检测不同裂解质粒在鳗弧菌中的裂解效果36-38
• 2.4.4 鳗弧菌裂解效果的扫描电镜观察38-39
• 2.5 本章小结39-40
• 第3章 基于限铁裂解系统的鳗弧菌减毒活疫苗开发40-45
• 3.1 引言40
• 3.2 实验用的材料40
• 3.2.1 菌株和质粒40
• 3.2.2 药品和试剂40
• 3.2.3 PCR引物40
• 3.2.4 试剂40
• 3.2.5 实验动物40
• 3.3 实验方法40-42
• 3.3.1 疫苗株的毒性评价41
• 3.3.2 疫苗株的免疫保护力评价41-42
• 3.4 结果与讨论42-44
• 3.4.1 鳗弧菌减毒活疫苗的构建及限铁诱导裂解的测定42-43
• 3.4.2 425/pUTP22的减毒效果43-44
• 3.5 本章小结44-45
• 第4章 Tn7转座子的开发应用45-56
• 4.1 引言45
• 4.2 实验用的材料45-46
• 4.2.1 菌株和质粒45-46
• 4.2.2 药品和试剂46
• 4.2.3 PCR引物46
• 4.2.4 试剂46
• 4.3 实验方法46-49
• 4.3.1 细菌培养及菌种保藏47
• 4.3.2 平末端连接实验47-48
• 4.3.3 鳗弧菌的四亲本接合48
• 4.3.4 迟钝爱德华氏菌的四亲本接合48-49
• 4.3.5 大肠杆菌的双质粒共转化49
• 4.3.6 抗性消除实验49
• 4.4 结果与讨论49-55
• 4.4.0 分析鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌中的attTn7位点49-50
• 4.4.1 Tn7转座子传递质粒的构建50-51
• 4.4.2 Tn7转座子在鳗弧菌中的应用51-52
• 4.4.3 Tn7转座子在迟钝爱德华氏菌中的应用52-53
• 4.4.4 Tn7转座子在大肠杆菌中的应用53-54
• 4.4.5 Tn7插入鳗弧菌后的抗性基因消除54-55
• 4.5 本章小结55-56
• 第5章 鳗弧菌载体疫苗的开发56-62
• 5.1 引言56
• 5.2 实验用的材料56-57
• 5.2.1 菌株和质粒56
• 5.2.2 药品和试剂56
• 5.2.3 PCR引物56-57
• 5.2.4 试剂57
• 5.3 实验方法57-58
• 5.4 结果与讨论58-61
• 5.4.1 双质粒系统58
• 5.4.2 单质粒系统58-59
• 5.4.3 抗原的染色体整合59-61
• 5.5 本章小结61-62
• 第6章 总结与展望62-64
• 6.1 全文总结62-63
• 6.2 展望63-64
• 参考文献64-71
• 致谢71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 智海东;王云峰;陈洪岩;;我国兽用基因工程疫苗研发现状与策略[J];动物医学进展;2011年06期

2 杨宇峰;王庆;聂湘平;王朝晖;;海水养殖发展与渔业环境管理研究进展[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2012年05期

3 孙娟;杨德利;;我国海水养殖业的可持续发展研究[J];山西农业科学;2011年07期

4 雷霁霖;;中国海水养殖大产业架构的战略思考[J];中国水产科学;2010年03期

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本文编号：604123