氯胺酮相关性膀胱炎大鼠模型的蛋白质组学研究及候选蛋白Transgelin的表达验证

发布时间：2017-08-01 20:06

  本文关键词：氯胺酮相关性膀胱炎大鼠模型的蛋白质组学研究及候选蛋白Transgelin的表达验证

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【摘要】：背景和目的 氯胺酮是苯环己哌啶的衍生物,是一种分离性麻醉药物。然而,越来越多的年轻人将它当作是一种娱乐性药物而滥用。有不少的临床病例报道已经指出：长期滥用氯胺酮会导致泌尿系病变,引起下尿路症状,如尿频、尿急、耻骨上区疼痛和血尿。对滥用氯胺酮的患者进行膀胱镜检查及膀胱组织活检,结果发现其病变与间质性膀胱炎(Interstitial Cystitis, IC)相类似。病情严重的患者常有膀胱体积减少及不可逆的肾功能损害。有学者认为,氯胺酮及其代谢产物可能对膀胱粘膜上皮产生直接毒性作用,继发引起粘膜下层及膀胱平滑肌的炎症反应,从而引起膀胱挛缩及一些与间质性膀胱炎类似的病变。但是氯胺酮导致类似间质性膀胱炎的病因学、疾病进展、预后及治疗方法仍未明确。 在前期的研究中,我们已经初步摸索出建立氯胺酮相关性膀胱炎的大鼠模型的条件。大鼠在连续接受腹腔注射氯胺酮16周后,出现了严重的尿频和肉眼血尿,病理学检查结果显示膀胱粘膜上皮层增厚伴随上皮纤维化、炎性细胞浸润等炎性病变。在本研究中,我们使用蛋白质组学的方法在组织学水平去研究氯胺酮相关性膀胱炎疾病发生、发展的相关蛋白,为阐明疾病的发生、发展,寻找疾病早期诊断和治疗的靶标提供初步的理论依据。 方法 1.建立氯胺酮相关性膀胱炎大鼠模型及膀胱组织病理学分析 采用2月龄,体重为180±10g的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只,随机分为空白对照control,生理盐水NS,低剂量组LK (10mg/kg),高剂量组HK(50mg/kg),饲养时间为16周。每只大鼠分别饲养在单独的代谢笼中,每日上午9时每组分别予腹腔注射500μl生理盐水,10mg/kg及50mg/kg氯胺酮。大鼠每周测量一次体重调整注射剂量。16周后,各组大鼠膀胱组织取材后行HE、Masson染色,观察膀胱粘膜层、粘膜下层及平滑肌层的组织学形态。 2.氯胺酮相关性膀胱炎大鼠模型膀胱组织的蛋白质组双向凝胶电泳 收集NS组及HK组的膀胱标本,使用双向凝胶电泳技术对两组标本进行了差异表达双向凝胶电泳分析。使用凝胶图像分析软件并结合人工比对从匹配点中筛选出两组间有显著性表达差异的蛋白点(P0.05),并从中挑选出表达差异1.5倍以上的蛋白点,进行后续的质谱分析。 3.双向凝胶电泳差异表达蛋白的质谱鉴定 对挑选出的差异蛋白斑点,通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)技术进行蛋白质鉴定分析,对得到的肽质量指纹图谱及其等电点、分子量、物种来源等参数在Mascot蛋白数据库进行检索,对蛋白进行鉴定。 4.差异蛋白的免疫印迹验证 采用免疫组化及western blot的方法对筛选鉴定出的差异蛋白进行蛋白水平的表达验证。使用磷酸化蛋白亲和色谱分离方法分离各组膀胱组织中的磷酸化及非磷酸化蛋白。使用western blot的方法检测各组膀胱组织中磷酸化及非磷酸化的候选差异蛋白的表达水平。 5.大鼠膀胱组织磷酸化蛋白的差异凝胶双向电泳及质谱鉴定 以NS组及HK组膀胱组织的磷酸化蛋白为研究对象,使用双向凝胶电泳结合质谱鉴定的方法对两组标本进行电泳分析,解析前述的双向电泳、免疫组化及western blot的检测结果。 结果 1.成功建立了氯胺酮相关性膀胱炎SD大鼠模型,LK、HK组大鼠均出现尿频、血尿等下尿路症状。HK组膀胱组织HE病理染色显示膀胱粘膜上皮层增厚,粘膜下层有大量炎性细胞浸润；Masson染色结果显示,与CON组及NS组相比,长期应用氯胺酮的HK组及LK组黏膜下层和肌层的纤维组织和胶原组织含量增加,染色深染。 2.成功得到氯胺酮相关性膀胱炎膀胱组织和生理盐水对照组膀胱组织的双向电泳图谱,共得到1200多个蛋白质斑点,使用凝胶分析软件分析了差异蛋白斑点,筛选出表达差异1.5倍及以上的蛋白点30个。 3.MALDI-TOF/MS仪结合Mascot数据库对上述30个蛋白点进行鉴定。最后成功鉴定差异表达蛋白29个,其中14个蛋白斑点在HK组膀胱组织中表达上调,它们分别被鉴定为T-激肽原,肌动蛋白丝束蛋白,ATP柠檬酸合成酶,线粒体乙醛脱氢酶,肌动蛋白,热休克蛋白β-6,转胶蛋白,蛋白质S100-A6及真核细胞转录启动子5A-1。15个蛋白斑点在HK组膀胱组织中表达下调,它们分别被鉴定为内质网素,含PCI区域蛋白2,血清白蛋白,角蛋白,蛋白质二硫腱异构酶A3,动脉平滑肌肌动蛋白,磷酸赖氨酸组氨酸焦磷酸盐磷酸酶,层粘连蛋白-A/C,醛糖还原酶,2-氧化戊二酸脱氢酶-二氢脂赖氨酸基琥珀酰转移酶复合物,1,6果糖双磷酸酶,磷脂酰肌醇转化蛋白α及转胶蛋白。复习文献后发现筛选出的蛋白仅有转胶蛋白Transgelin曾在研究报道过与膀胱损害有相关性,其表达可能与间质性膀胱炎发生发展可能相关,其余蛋白目前暂未见与膀胱炎的相关报道。 4.免疫组织化学及western blot结果显示Transgelin蛋白在空白对照组、NS组、LK组及HK组间的表达水平无明显差异(P0.05)。磷酸化形式的Transgelin蛋白在HK组、LK组的表达水平均高于CON组及NS组(P0.05),而非磷酸化形式的Transgelin蛋白在HK组、LK组的表达水平均低于CON组及NS组(P0.05)。 5.成功得到HK组和NS组膀胱磷酸化蛋白的双向电泳图谱,使用凝胶分析软件分析了差异蛋白斑点,筛选出表达差异1.5倍及以上的蛋白点11个。最后成功鉴定差异表达蛋白8个斑点在HK组中表达上调,它们分别被鉴定为：同型原肌球蛋白α-1、真核细胞翻译起始因子2-1、转胶蛋白、肌动蛋白、蛋白酶β3型、肌球蛋白调控子轻链多肽-9、肌球蛋白调控子轻链RLC-A及My16蛋白。 结论： 1.成功建立氯胺酮相关性膀胱炎大鼠模型,膀胱组织病理学检查结果显示膀胱病变与临床患者病变相似； 2.采用双向凝胶电泳联合质谱的蛋白质组学研究方法鉴定了29个差异表达蛋白,筛选出氯胺酮相关性膀胱炎发生发展相关蛋白1个； 3.转胶蛋白(Transgelin)是本研究筛选获得的蛋白。Transgelin在膀胱平滑肌组织中的磷酸化形式的表达量明显上调,进一步行磷酸化蛋白的双向凝胶蛋白电泳、western blot验证及查阅相关研究资料后,我们提出以下假说：长期滥用氯胺酮,可能会促进膀胱平滑肌中的Transgelin的磷酸化修饰,阻碍它与肌动蛋白的结合,最终破坏平滑肌细胞的正常调控及影响膀胱的收缩功能。它可能是一种有应用价值的预测氯胺酮相关性膀胱炎发生发展的重要标志物。
【关键词】：蛋白质组 氯胺酮相关性膀胱炎 双向凝胶电泳 转胶蛋白 磷酸化蛋白
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R694.3
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-18
• 第一章 建立氯胺酮相关性膀胱炎大鼠模型18-27
• 1. 研究背景18-19
• 2. 材料与方法19-22
• 3. 结果22-25
• 4. 讨论25-27
• 第二章 氯胺酮相关性膀胱炎的蛋白质组双向差异电泳分析及质谱鉴定27-44
• 1. 研究背景27
• 2. 材料与方法27-35
• 3. 结果35-41
• 4. 讨论41-44
• 第三章 差异候选蛋白的免疫印迹验证和模型动物膀胱磷酸化蛋白的双向凝胶电泳分析及质谱鉴定44-61
• 1. 研究背景44
• 2. 材料与方法44-53
• 3. 结果53-58
• 4. 讨论58-61
• 参考文献61-66
• 全文总结66-68
• 缩写词简表68-69
• 硕士研究生期间参与发表论文情况69-70
• 致谢70-71

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1 项国联;裴春明;李天佐;;氯胺酮复合异丙酚镇静用于老年男性膀胱镜检查的临床研究[J];中华老年医学杂志;2006年07期

2 孙立国;苑光辉;马鲁飞;;腺性膀胱炎的诊断和治疗(附38例报告)[J];华北煤炭医学院学报;2006年03期

3 刘r，

本文编号：605951