重组β防御素3载体的构建及其抗菌活性初探

发布时间：2017-08-03 15:29

  本文关键词：重组β防御素3载体的构建及其抗菌活性初探

  更多相关文章： ELP-SPM表达系统 HBD-3 抗菌活性 白念珠菌 金黄色葡萄球菌

【摘要】：防御素是近年来发现的人体抵抗病原微生物的重要物质—抗菌肽中的一大类,大小约为3-5KDa,是一种富含半胱氨酸的阳离子短肽类物质,它在特异性免疫和非特异性免疫中都具有重要的作用,它可以拮抗包括G+菌、G-菌、真菌、病毒、原虫等在内的多种病原体且不易产生耐药性。 现今抗生素的广泛使用,产生的各种问题,如体内药物的残留、过敏反应、耐药性,迫使人类急需开发一种新型抗菌物质,因此抗菌肽的研究开发利用成为一个热点。防御素是抗菌肽家族中的一大类,为一种含有β-片层结构的阳离子活性肽,人防御素类别中的人β防御素-3(Human beta-defensin-3, HBD-3)最初是在银屑病患者的皮损组织提取物中发现的,且在皮肤、扁桃体、呼吸道、生殖道上皮细胞、成年人骨骼肌、心脏、胸腺、食道、口腔黏膜、气管和胎盘均有不同程度的表达,HBD-3由于其抗菌谱广,盐浓度对其影响相对小,对宿主细胞的毒性低,且对多重耐药菌有效,因此具有较高的研究价值。 本研究根据大肠杆菌的偏好密码子,人工设计并合成了HBD-3基因,克隆到原核表达载体pET30a-SPM-ELP中,获得重组表达载体pET-30a-ELP-SPM-HBD-3.本实验所使用的弹性蛋白样多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)介导的原核表达载体系统,是目前最为成功的外源性蛋白表达系统之一。载体中的ELP是一类人工合成的生物大分子,由五肽重复序列单元VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly, Xaa可以是除Pro在外的任何一种氨基酸)。ELP具有温度诱导的可逆变特性,即在高于某一特定相变温度的溶液中呈现凝聚的状态,在低于这一温度时为可溶的状态。ELP融合蛋白也具有与ELP相似的性质,因此能通过此特性,用温度控制和离心法来分离前体蛋白。自我剪接单元(self-processing module, SPM)为一具有自我剪切特性的标签的单元,在有Ca2+存在条件下可执行自我剪切功能,可利用钙离子切割液来切割获取目的小蛋白。本研究利用其中弹性蛋白样多肽(ELP)系统具有的温度诱导反复相变特性,以低温诱导法诱导重组菌表达,在不同温度进行反复离心洗涤结合盐离子的沉淀,获得了融合蛋白。经过SDS-PAGE检测证明能表达预期分子量大小的融合前体蛋白ELP-SPM-HBD3,再切割,获得目的蛋白后,利用琼脂扩散法来测定其体外抗白念珠菌活性,通过琼脂扩散法,MIC测定及动物模型来测定其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果证实本实验研究中重组表达载体所表达的HBD-3具有一定的抗白色念珠菌及金黄色葡萄球菌活性,其最小抑制金黄色葡萄球菌浓度为80μg/ml,且对金黄色葡萄球菌动物感染模型也有一定的抗感染作用。 本实验方法中重组蛋白的分离、纯化过程简单,生产成本低,且表达出的HBD-3有一定的抗菌活性,故可为进一步研究和开发HBD-3奠定基础。
【关键词】：ELP-SPM表达系统 HBD-3 抗菌活性 白念珠菌 金黄色葡萄球菌
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 符号说明8-10
• 第一章：文献综述10-16
• 1 人β-防御素的结构10-11
• 2 HBD-3的生物学功能11-14
• 3 HBD-3应用14-16
• 第二章：研究内容一重组β防御素3载体的构建16-36
• 1 实验材料16-19
• 2 实验方法19-27
• 3 实验结果与分析27-34
• 4 讨论34-36
• 研究内容二：重组β防御素3对白念珠菌及的金黄色葡萄球菌的作用36-47
• 1 实验材料36-37
• 2 实验方法37-41
• 3 结果41-45
• 4 讨论45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 致谢53-54

【共引文献】

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本文编号：615072