邮致敏蛋白Pen a 1抗原表位多克隆抗体的制备及应用

发布时间：2017-08-04 03:09

  本文关键词：邮致敏蛋白Pen a 1抗原表位多克隆抗体的制备及应用

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【摘要】：虾类等海产品因其营养、美味一直是人们钟爱的美食，其消费量及出口量均处于重要地位。但它也是引起食物过敏的重要过敏原之一，这不但对消费者的身体健康及生命安全有巨大的威胁，同时也不利于我国国际贸易的健康发展。因此，开展虾类过敏原的相关研究受到研究者的极大关注。随着过敏原研究的逐步深入，人们对过敏原抗原表位的识别和鉴定技术越发成熟。抗原表位是过敏原引发过敏反应的基础，基于过敏原的抗原表位开展一系列的研究将具有重要的理论及实际意义。 本文以虾中存在的最主要的一种致敏蛋白P en a1（tropomyosin）的抗原表位为研究对象，其研究内容及结果如下： 1. Pen a1抗原表位多肽的合成。采用Fmoc法化学合成针对Pen a1抗原表位的5个多肽片段，并将多肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联制得五5种人工免疫原及5种人工包被原。反向高效液相色谱检测多肽合成纯度分别为：85.97%、88.85%、92.76%、95.44%和88.00%，均达到免疫原纯度要求。斑点免疫法验证合成多肽生物活性良好。采用Ellman试剂检测多肽与载体蛋白的偶联率，偶联效果较好。 2. Pen a1抗原表位抗体的制备及鉴定。5种人工免疫原分别免疫新西兰纯种白兔，获得五种多抗血清，其抗体效价均达到1.024106，较理想。分别以5种多肽为竞争物，进行间接竞争ELISA（ic-ELISA），获得对应回归方程，计算得其IC50分别为：0.1574μg mL~(-1)、0.4324μg mL~(-1)、0.2291μg mL~(-1)、0.1145μg mL~(-1)和0.3605μg mL~(-1)。 3. Pen a1表位抗体制备免疫亲和柱及其效能测定。选择特异性良好且抗血清获得量较大的第5号表位多肽抗血清，抗血清经辛酸-硫酸铵及特异性血清纯化预装柱纯化后与溴化氰活化的琼脂糖凝4B进行偶联，Bradford法测定其偶联率为90.76%。ic-ELISA测定1mL偶联介质的吸附容量为2.84mg Pen a1，免疫亲和柱的加标回收率为89.6%-93.6%，亲和柱使用寿命为4次。 4. Pen a1表位抗体用于食品中虾致敏蛋白的快速检测研究。选取市售的标签中标注含有虾肉成分和不含虾肉成分的8种具有代表性的食品，利用Pen a1的第2个表位抗体对食品中是否含有虾过敏成分进行定性及定量判定，其中定性判定结果与标签一致，并且对于标签标示不详的食品，也具有较好的识别性，同时还可大致估算出食品中所含的虾过敏蛋白的含量。 5. Pen a1表位抗体用于检测辐照对Pen a1免疫原性的影响。对提取纯化的2mg/mL的Pen a1采用-射线进行辐照处理，，辐照剂量为0、6.7kGy，利用SDS-PAGE结合MALDI-TOF MS测定，发现辐照后，36kD的Pen a1蛋白溶液中出现了约20kD、60kD以及40kD左右的新的条带。Western Bolt验证了60kD附近的蛋白条带也可被5个表位抗体识别，表明表位抗体在检测的过程中具有较好的特异性。 综上，本文尝试了从致敏蛋白抗原表位出发，对表位对应的多肽片段进行合成、鉴定、偶联和制备抗体，同时利用抗体进行免疫亲和柱的制备、食品中相应致敏蛋白的检测及检测蛋白经辐照处理后蛋白表位对应的免疫原性的变化情况，为开发致敏蛋白的免疫亲和技术、食品中致敏蛋白的检测及加工处理方法对致敏蛋白脱敏机理的研究奠定基础。
【关键词】：虾致敏蛋白Pen a1 表位抗体 酶联免疫吸附试验
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;Q78
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 绪论13-24
• 1.1 食物过敏原概述13-16
• 1.1.1 食物过敏原的定义13
• 1.1.2 食物过敏原的种类13-15
• 1.1.3 食物过敏的发病机制15-16
• 1.2 致敏蛋白纯化技术和食物过敏原检测技术的研究现状16-18
• 1.2.1 致敏蛋白纯化技术的研究现状16-17
• 1.2.2 食物过敏原检测技术研究现状17-18
• 1.3 食品加工对过敏原活性的影响18-20
• 1.3.1 物理法18-19
• 1.3.2 化学法19-20
• 1.3.3 生物法20
• 1.4 食物过敏原抗原表位概述20-22
• 1.4.1 食物过敏原抗原表位的定义20-21
• 1.4.2 食物过敏原抗原表位的种类21
• 1.4.3 食物过敏原抗原表位的鉴定研究进展21-22
• 1.4.4 虾过敏原抗原表位的研究进展22
• 1.5 本研究的立题目的及意义22-23
• 1.6 本研究的研究内容23-24
• 第二章 Pen a 1 表位多肽的设计合成24-31
• 2.1 仪器与试剂24-25
• 2.1.1 实验仪器24
• 2.1.2 材料与试剂24
• 2.1.3 溶液配制24-25
• 2.2 实验方法25-26
• 2.2.1 Pen a 1 表位多肽的设计25
• 2.2.2 多肽的合成及纯度分析25
• 2.2.3 合成多肽的偶联25-26
• 2.2.4 免疫斑点法分析合成多肽的生物活性26
• 2.3 结果与分析26-29
• 2.3.1 合成多肽的准确度及纯度分析26-28
• 2.3.2 合成多肽的偶联结果测定28-29
• 2.3.3 合成多肽的生物活性初步验证29
• 2.4 讨论29-30
• 2.5 本章小结30-31
• 第三章 Pen a 1 抗原表位抗体的制备及鉴定31-38
• 3.1 仪器与试剂31-32
• 3.1.1 实验仪器31
• 3.1.2 材料与试剂31-32
• 3.1.3 溶液的配制32
• 3.2 实验方法32-34
• 3.2.1 动物免疫32-33
• 3.2.2 间接 ELISA 测定血清效价33-34
• 3.2.3 抗原抗体最佳工作浓度筛选34
• 3.2.4 多克隆抗体灵敏度的测定34
• 3.3 结果与分析34-37
• 3.3.1 兔血清效价测定34-35
• 3.3.2 抗原抗体最佳工作浓度确定35
• 3.3.3 多克隆抗体对多肽灵敏度的测定35-37
• 3.4 讨论37
• 3.5 本章小结37-38
• 第四章 Pen a 1 表位抗体用于制备免疫亲和柱的研究38-53
• 4.1 仪器与试剂38-41
• 4.1.1 实验仪器38-39
• 4.1.2 材料与试剂39
• 4.1.3 溶液配制39-41
• 4.2 实验方法41-44
• 4.2.1 虾致敏蛋白 Pen a 1 提取、纯化及鉴定41-42
• 4.2.2 Pen a 1 表位抗体的选择与纯化42-43
• 4.2.3 间接竞争 ELISA 检测方法的建立43
• 4.2.4 免疫亲和柱的制备43
• 4.2.5 免疫亲和柱效能的测定43-44
• 4.3 结果与分析44-51
• 4.3.1 虾致敏蛋白 Pen a 1 纯化效果鉴定44-47
• 4.3.2 Pen a 1 表位抗体的筛选与纯化结果47-48
• 4.3.3 间接竞争 ELISA 检测方法的建立48
• 4.3.4 抗体与凝胶介质的偶联率的测定48-49
• 4.3.5 免疫亲和柱效能的测定49-51
• 4.4 讨论51
• 4.5 小结51-53
• 第五章 ：Pen a 1 表位抗体用于食品中虾致敏蛋白的快速检测53-57
• 5.1 仪器与试剂53-54
• 5.1.1 实验仪器53
• 5.1.2 材料与试剂53-54
• 5.1.3 溶液配制54
• 5.2 实验方法54-55
• 5.2.0 样品选择54
• 5.2.1 样品蛋白提取54
• 5.2.2 测试方法54-55
• 5.3 结果与分析55-56
• 5.3.1 多肽测定标准曲线的绘制55
• 5.3.2 样品虾过敏成分定性判定55-56
• 5.3.3 样品虾过敏成分含量计算56
• 5.4 讨论56
• 5.5 本章小结56-57
• 第六章 ：表位抗体用于检测辐照对 Pen a 1 免疫原性的影响57-62
• 6.1 仪器与试剂57-58
• 6.1.1 实验仪器57-58
• 6.1.2 材料与试剂58
• 6.1.3 溶液配制58
• 6.2 实验方法58-59
• 6.2.1 Pen a 1 蛋白的辐照处理58
• 6.2.2 辐照对 Pen a 1 的分子量的影响测定58
• 6.2.3 辐照对 Pen a 1 免疫原性的影响测定58-59
• 6.3 结果与分析59-61
• 6.3.1 辐照剂量确定59
• 6.3.2 辐照对 Pen a 1 的分子量的影响59-60
• 6.3.3 辐照对 Pen a 1 免疫原性的影响60-61
• 6.4 小结61-62
• 第七章 ：结论与展望62-63
• 7.1 结论62
• 7.2 展望62-63
• 参考文献63-68
• 致谢68-69
• 作者简历69

【参考文献】

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本文编号：617465