血清胸苷激酶单克隆抗体酶促化学发光试剂盒的研制

发布时间：2017-08-05 05:06

  本文关键词：血清胸苷激酶单克隆抗体酶促化学发光试剂盒的研制

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【摘要】：目的研制特异性强、灵敏度高的检测S-TK1(血清胸苷激酶)的单克隆抗体酶促化学发光试剂盒,以用于肿瘤早期检测、预后和术后观察及临床疗效监控。 方法 一制备一对抗S-TK1单克隆抗体。 1抗体制备 A.设计并合成长度为15个氨基酸的S-TK1多肽,并与载体蛋白KLH耦联制备多肽抗原； B.从Raji细胞提取物中纯化获得TK1抗原蛋白； C.抗S-TK1多肽抗原单克隆抗体的制备：常规免疫Balb/c小鼠,选择血清抗体滴度较高的小鼠,取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选获得7株高亲和力的抗S-TK1多肽的单克隆抗体,用于制备包被抗体； D.抗Raji细胞TK1抗原蛋白单克隆抗体的制备：方法如C,获得3株高亲和力的Raji细胞TK1抗原蛋白单克隆抗体,用于制备检测抗体： 2.抗体鉴定通过对小鼠进行小规模的腹水生产,用蛋白质A亲合柱从每个腹水样本中分离纯化单克隆抗体,经ELISA.免疫印迹法鉴定单克隆抗体效价、特异性、亲和力以及种属交叉反应,最后用旋转瓶培养技术进行抗体生产。二制作S-TK1酶促化学发光试剂盒 1抗体配对将7株高亲和力的抗S-TK1多肽的单克隆抗体和3株高亲和力的Raji细胞TK1抗原蛋白单克隆抗体配对,用ELISA进行测试。 2标记抗体使用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记检测抗体。 3化学发光法试剂盒工作参数的确定以鲁米诺、对-2甲苯酚、吐温-20为化学发光底物；经比较确定包被抗体和检测抗体的稀释度；包被抗体即用稀释的抗体加在酶标板上4℃温育过夜,之后洗涤,干燥过夜,用透明胶带封存。 4试剂盒技术参数的测定即灵敏度、准确度、精密度、稳定性、特异性、相关性测定。 结果通过实验得到灵敏度高的10株抗体,它们是Antip-1-1A9; Antip-1-3D3; Antip-1-4B5; Antip-1-4D3; Antip-1-4F7; Antip-2-2B7; Antip-2-8E11; Antir-1-6A7;Antir-1-9H5;Antir-2-7D6.通过对效价、特异性、亲和力、种属交叉反应检测均在较好范围。经过配对实验最终选定配对灵敏度最高的一对抗体,即包被抗体Antip-1-4D3和检测抗体Antir-1-9H5,作为配对抗体。包被浓度为5μg/ml, HRP标记的抗体稀释度为1：1500。确定化学发光试剂盒的检测正常范围为≤2.0pM,阳性范围为2.0pM。试剂盒技术参数的测定结果如下：灵敏度0.156PM、准确度回收率95%和104%、精密度CV值批内4.5%和5.7%,批间9.4%和9.0%、稳定性5d内稳定、特异性与TG(甲状腺球蛋白)交叉反应率0.25%、相关性回归方程Y=0.1235+0.9945X,相关系数r=0.9997(P0.01)。 结论通过本实验得到一种血清胸苷激酶1(S-TK1)单克隆抗体酶联化学发光诊断试剂盒,通过各项检测试验,证实该试剂盒具有较高灵敏度和特异性,且该试剂盒简便易操作,有望成为癌症早期诊断的广谱性试剂盒。
【关键词】：血清胸苷激酶1(S-TK1) 肿瘤标志物 单克隆抗体 化学发光试剂盒 检测方法
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、血清胸苷激酶单克隆抗体酶制备14-27
• 1.1 材料和方法14-18
• 1.1.1 材料14-15
• 1.1.2 方法15-18
• 1.2 结果18-25
• 1.2.1 单克隆抗体筛选结果18-22
• 1.2.2 抗体鉴定结果22-25
• 1.3 讨论25-26
• 1.3.1 血清胸苷激酶升高或降低25
• 1.3.2 TK1结构和序列的选择25
• 1.3.3 杂交瘤细胞制备单克隆抗体25-26
• 1.3.4 Raji细胞特点26
• 1.4 小结26-27
• 二、血清胸苷激酶单克隆抗体酶促化学发光试剂盒的制作27-34
• 2.1 材料与方法27-29
• 2.1.1 材料27
• 2.1.2 方法27-29
• 2.2 结果29-31
• 2.2.1 抗体配对结果29-30
• 2.2.2 试剂盒工作参数的确立与优化30-31
• 2.2.3 试剂盒技术参数测定结果31
• 2.3 讨论31-33
• 2.3.1 TK1的常见的检测方法31
• 2.3.2 放射同位素法31
• 2.3.3 ELISA法31-32
• 2.3.4 免疫点印迹法32
• 2.3.5 增强化学发光点印迹法32
• 2.3.6 本实验研制的试剂盒采用的方法32
• 2.3.7 本方法的影响因素32-33
• 2.4 小结33-34
• 结论34-35
• 参考文献35-37
• 发表论文37-38
• 综述38-47
• 胸苷激酶1的研究与检测方法的进展38-45
• 综述参考文献45-47
• 致谢47

【参考文献】

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1 陈曲波;刘瑞萍;黄惠;李强;张健媛;郑松柏;李倩s，

本文编号：623238