TGF-β1联合hUCMSCs移植对SUI模型鼠尿道周围结缔组织中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin表达的
发布时间：2017-08-06 06:06
本文关键词：TGF-β1联合hUCMSCs移植对SUI模型鼠尿道周围结缔组织中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin表达的影响
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【摘要】：研究目的： 1.建立从足月剖宫产孕妇脐带分离间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、体外传代培养扩增的方法，研究其生物学特征，为后续实验提供细胞源。 2.培养基中添加TGF-β1诱导人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）定向分化为成纤维细胞（fibroblast），为进一步实验奠定基础。 3.通过模拟人类妊娠分娩、难产、产伤、卵巢去势建立SD大鼠SUI的动物模型，将外源性TGF-β1联合hUCMSCs注射于尿道周围，根据尿动力学、喷嚏实验、尿道及膀胱组织形态学和弹性纤维的改变，观察细胞移植治疗对尿道及其周围组织和膀胱中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin表达的影响，为SUI的治疗提供依据。 方法： 1．无菌条件下取足月剖宫产的健康新生儿近脐部脐带，应用组织块贴壁法分离培养。 2．应用流式细胞仪检测细胞表面标志物；光学显微镜下观察细胞的形态学特征；CCK8法检测细胞的增殖能力并绘制生长曲线；体外诱导其向成脂细胞和成骨细胞分化来鉴定其多向分化能力。 3.制备细胞爬片，实验组加TGF-β1（5ng/ml），对照组正常培养，诱导7天后免疫组化鉴定波形蛋白（Vimentin）、I型胶原的表达。 4.SUI动物模型的建立：①实验组：SD孕鼠分娩后2小时内麻醉，将14Fr弗莱氏导尿管插入阴道约2-3cm并固定，气囊内注入5ml生理盐水，维持此状态4h；2周后行双侧卵巢剔除术，常规饲养。②阳性对照组：SD孕鼠分娩后2小时内麻醉，将14Fr弗莱氏导尿管插入阴道2-3cm并维持此状态4h，常规饲养。③阴性对照组：常规饲养，未予特殊处理。全部实验SD大鼠均用BL-420生物机能实验系统进行尿动力学检测，再行喷嚏实验来验证大鼠SUI模型建立是否成功。 5.将SUI模型鼠分为3组:一组注射生理盐水，一组注射hUCMSCs，另一组注射TGF-β1联合hUCMSCs，常规饲养6周后行尿动力学检测和喷嚏实验。 6.处死大鼠，取材于尿道及其周围组织和膀胱，经过HE、弹力纤维染色观察尿道及其周围组织和膀胱的形态学变化以及弹性纤维的变化情况；免疫组化、RT-PCR检测组织中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的变化。 结果： 1.采用组织块贴壁法在7-12天开始爬出细胞，3周后可首次传代获得原代细胞，细胞呈长梭形、成纤维细胞样，漩涡状生长，传代后生长速度明显增快，细胞形态更为均匀一致；细胞生长曲线表明细胞从第3天起进入对数生长期；培养的第3代细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD105，而造血细胞表面标志物CD45、内皮细胞标志物CD31、移植免疫排斥密切相关的表面标志物CD40和HLA-DR均极低表达；体外实验证实本实验培养的细胞能被诱导为成脂细胞和成骨细胞，说明所培养的细胞是间充质干细胞。 2.通过鉴定细胞中I型胶原、Vimentin的表达，证明体外实验中TGF-β1能诱导hUCMSCs向成纤维细胞分化，为后续实验奠定基础。 3.模拟人类妊娠分娩、难产、产伤、卵巢去势可以建立稳定的SUI大鼠模型。实验组、阳性对照组和阴性对照组大鼠的最大膀胱容量分别为1.67±0.37ml、2.94±0.12ml、3.1±0.27ml，漏尿点压力分别为27.22±2.42mmHg、32.06±1.20mmHg、32.86±1.64mmHg。这2个指标实验组均明显低于两对照组（P㩳0.05），两对照组之间无统计学差异（P㧐0.05）。实验组喷嚏实验阳性率（76.2%）明显高于对照组。尿道及其周围组织和膀胱行HE染色形态学观察：实验组与阴性和阳性对照组相比，尿道肌层明显变薄，部分肌层出现断裂现象；筋膜间结缔组织成分增加，弹性纤维疏松，排列紊乱。实验组膀胱组织HE染色可见肌层纤细并出现断裂现象。弹力纤维染色提示实验组大鼠尿道及其周围结缔组织弹性纤维弯曲度降低、细小、密度低，出现碎裂、崩解，排列无规则。膀胱组织弹力纤维染色在实验组和对照组间无明显差异，均仅可见血管周围弹力纤维染色明显。 4. SUI模型大鼠尿道周围注射hUCMSCs：实验组分为注射hUCMSCs、hUCMSCs+TGF-β1和生理盐水组3组。hUCMSCs和hUCMSCs联合TGF-β1移植组漏尿点压力分别为30.63±1.49mmHg、31.05±2.13mmHg，最大膀胱容量分别为2.93±0.26ml、2.94±0.31ml均明显高于生理盐水组，生理盐水注射治疗前后无明显统计学差异（P㧐0.05），hUCMSCs和hUCMSCs联合TGF-β1移植组之间比较无统计学差异(P㧐0.05)，两组喷嚏实验阳性率低于生理盐水注射组。尿道及其周围组织和膀胱行HE染色形态学观察：与生理盐水注射组相比，hUCMSCs和hUCMSCs联合TGF-β1组尿道肌层较增厚，，肌层和结缔组织间联系紧密。膀胱组织可见肌层明显增厚、连续。弹力纤维染色显示生理盐水组尿道及其周围结缔组织中弹性纤维细小、密度低、排列不规则，而hUCMSCs和hUCMSCs联合TGF-β1组弹性纤维明显增加、排列整齐。膀胱组织弹力纤维染色不明显。 5.尿道及其周围组织和膀胱组织免疫组化检测Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的变化情况：与注射生理盐水组相比，hUCMSCs和hUCMSCs联合TGF-β1组上述指标的表达均增加。RT-PCR结果显示hUCMSCs联合TGF-β1能增加Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的表达，差异有统计学意义。 结论： 1.应用贴壁法可获得较纯的hUCMSCs，纯化的hUCMSCs极低表达CD31、CD45、CD40、HLA-DＲ，强表达CD29、CD90、CD44、CD105。细胞在体外具有良好的扩增能力，性状稳定。通过鉴定细胞中I型胶原、Vimentin的表达，证明体外实验中TGF-β1能诱导hUCMSCs向成纤维细胞，为后续实验奠定基础。 2.根据SUI的发病机制，模拟人类妊娠、难产、产伤、卵巢去势，通过尿道动力学指标、喷嚏实验阳性率的比较可建立稳定的SUI动物模型。HE染色和弹力纤维染色结果提示SUI模型鼠尿道及其周围组织和膀胱组织中结构不完整、弹性纤维出现断裂现象。 3.对于本实验中建立的SUI模型鼠，外源性TGF-β1联合hUCMSCs可促进尿道及其周围组织和膀胱组织中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的表达，通过修复弹性蛋白及其相关蛋白的缺陷而有效修复盆底连接组织，参与盆底结构与功能的重塑过程。
【关键词】：压力性尿失禁 移植治疗 脐带间充质干细胞 类赖氨酰氧化酶-1 Fibulin-5 弹性蛋白
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R711.59
【目录】：
- 中文摘要3-7
- Abstract7-11
- 目录11-12
- 英文缩略词12-14
- 前言14-18
- 第一章 脐带间充质干细胞的体外分离培养与鉴定18-27
- 1 研究目的18
- 2 材料与方法18-23
- 3 实验结果23-25
- 4 讨论25-26
- 5 结论26-27
- 第二章 TGF β1 体外诱导 hUCMSCs 分化为成纤维细胞的研究27-31
- 1 研究目的27
- 2 材料与方法27-28
- 3 实验结果28-29
- 4 讨论29-30
- 5 结论30-31
- 第三章 压力性尿失禁大鼠动物模型的建立与鉴定31-39
- 1 研究目的31
- 2 材料与方法31-35
- 3 结果35-37
- 4 讨论37-39
- 5 结论39
- 第四章 TGF β1 联合 hUCMSCs 移植治疗 SUI 模型鼠的实验研究39-49
- 1 研究目的39-40
- 2 材料与方法40-42
- 3 结果42-47
- 4 讨论47-49
- 5 结论49
- 攻读硕士期间发表的论文49-50
- 致谢50-51
- 参考文献51-56
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 徐燕;李长虹;孟恒星;郝牧;邱录贵;;人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年32期
2 罗新;;女性盆底解剖结构的新概念[J];中国实用妇科与产科杂志;2006年01期
3 卫向阳,刘维永,孙国成,欧阳辉,顾春虎,刘兴光;犬骨髓间充质干细胞体外分离、诱导成纤维细胞的实验研究[J];中华外科杂志;2005年18期
4 曾洁;刘娟;;压力性尿失禁大鼠模型建立的研究[J];中国妇幼保健;2013年04期
本文编号：628628
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