消减免疫法筛选HPV型间杂合颗粒特异单克隆抗体及其表位研究

发布时间：2017-08-09 05:14

  本文关键词：消减免疫法筛选HPV型间杂合颗粒特异单克隆抗体及其表位研究

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【摘要】：人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的持续感染被证实是诱发女性宫颈癌的主要原因。世界范围内,每年由HPV感染所致癌症病例56万例,约占全球全部癌症新发病例的5%,死亡人数约20万；在中国,每年约有10万的妇女因HPV感染而导致宫颈癌,死亡病例约3万。宫颈癌是继乳腺癌之后严重威胁妇女健康的第二大疾病。与宫颈癌密切相关的高危型HPV有15种,要有效控制宫颈癌就必须有预防这15种型别HPV感染的疫苗。目前上市的2种疫苗只能预防HPV16和HPV18这两种高危型的感染,保护率约占70%。因此,开发多价预防疫苗具有重大意义,同时也面临巨大的挑战。 本文在实验室前期的研究基础上,通过HPV16L1的C175和HPV52L1的C428位点突变,获得两种突变蛋白,混合组装成均一的、与野生型VLP形态相似的杂合病毒样颗粒(Virus Like Particle, VLP)。通过免疫原性考察,相同剂量的杂合VLP与野生型VLP所诱导的抗体水平相当,表明杂合VLP有作为广谱HPV疫苗的潜力。由于杂合VLP两个相邻五聚体之间只能形成一个二硫键,在空间结构上必然与野生型VLP不同,因此,杂合VLP有可能会产生新的功能表位,甚至可能产生新的广谱表位。因此,筛选出针对杂合VLP特异反应的单抗,同时通过该抗体分析杂合VLP相对于野生型VLP所产生的新表位具有重要意义。 本研究首先通过单克隆抗体筛选获得了针对于杂合VLP特异反应的单抗。在常规的免疫方法中,HPV杂合VLP的免疫血清抗体滴度与两种野生型免疫的抗体滴度相当,筛选获得的抗体差异性不大,且没有针对杂合VLP新表位的单抗。因此本研究采用环磷酰胺消减免疫法,环磷酰胺可以抑制非目的抗原的免疫原性,提高免疫系统对目的抗原的应答。本文针对HPV抗原的免疫进行一系列摸索,最后建立的消减免疫方案是：耐受阶段和免疫阶段均不使用佐剂,抗原剂量为20μg,腹腔注射,环磷酰胺剂量为100mg/kg。对消减次数的研究表明,耐受次数不影响免疫抑制的持久性,停止环磷酰胺处理后,免疫抑制状态可以维持4周。 本研究中,先使小鼠免疫系统对HPV16和HPV52野生型VLP的免疫无应答,再以杂合VLP免疫小鼠,使少量的五聚体杂合特异的表位免疫应答得到加强,提高特异抗体的阳性率,减少筛选工作量。筛选获得的抗体中,有2株抗体对杂合VLP特异,4株抗体对杂合VLP和野生型VLP的反应差异性在10倍以上。证实了环磷酰胺消减免疫法可以有效地制备差异性抗体。 我们接着利用分子模拟方法,对以上抗体识别的表位进行分析。选取杂合VLP的特异性抗体2B3,分别对抗体可变区和HPV16/52相邻五聚体进行同源模建和分子对接,预测出2B3与杂合VLP的相互作用区域在两个五聚体之间,关键氨基酸是HPV16五聚体的Ser170和Lys439, HPV52五聚体的Asn240、Ser255、 Glu378、Lys382和Glu469。 综上所述,本研究通过对消减免疫方案的研究,建立了以HPV为抗原的消减免疫方案,由此筛选获得了杂合VLP特异性抗体和与野生型VLP具有较大差异性的抗体。利用生物信息学分子对接技术,进一步研究了特异性抗体识别的杂合VLP的特异表位。本研究获得的杂合VLP特异表位信息,对于了解HPV L1蛋白的分子进化,中和表位型别的特异性,杂合VLP组装的机制以及开发基于杂合VLP的HPV广谱疫苗具有重要的指导意义。
【关键词】：人乳头瘤病毒 型间杂合病毒样颗粒 消减免疫 表位 分子模拟
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词8-15
• 第一章 前言15-46
• 1. HPV简介15-27
• 1.1 HPV基因组结构15-16
• 1.2 HPV的组装16-17
• 1.3 病毒的感染途径和传播方式17-18
• 1.4 人乳头瘤病毒的分类18-20
• 1.5 HPV的致病机制20-22
• 1.6 HPV的流行病学22-24
• 1.7 HPV的免疫24-27
• 2. HPV疫苗的研究27-33
• 2.1 预防性疫苗的研究27-31
• 2.2 治疗性疫苗的研究31-33
• 3. 消减免疫的种类和应用33-38
• 3.1 高区带耐受消减免疫法33-34
• 3.2 新生期耐受消减免疫法34-36
• 3.3 药物介导耐受消减免疫法36-38
• 4. 抗原表位的研究方法38-44
• 4.1 氨基酸替换和突变技术39
• 4.2 肽扫描技术39
• 4.3 生物信息学工具预测分析39-41
• 4.4 免疫复合物晶体结构解析41-43
• 4.5 其他抗原表位研究方法43-44
• 5. 本研究的思路、目的和意义44-46
• 第二章 材料与方法46-73
• 1 仪器46-47
• 2 主要耗材47-48
• 3 主要试剂与实验动物48-54
• 3.1 菌株、质粒、酶和软件48
• 3.2 单克隆抗体、细胞株及实验动物48-49
• 3.3 其它试剂49
• 3.4 常见溶液及培养基的配制49-54
• 4 方法54-59
• 4.1 分子生物学实验方法54-57
• 4.2 蛋白诱导表达、纯化及鉴定方法57-59
• 5 小鼠免疫及免疫评价实验方法59-73
• 5.1 小鼠常规免疫59-60
• 5.2 小鼠消减免疫60
• 5.3 融合杂交瘤的筛选60-63
• 5.4 杂交瘤细胞的培养63-64
• 5.5 单克隆抗体的制备及性质鉴定64-68
• 5.6 单抗的表位鉴定68-73
• 第三章 结果与分析73-105
• 1. 消减免疫方案的研究73-87
• 1.1 小鼠免疫原的制备73-76
• 1.2 HPV杂合VLP免疫原性考察76-78
• 1.3 消减免疫耐受方案研究78-84
• 1.4 消减次数对耐受持久性的影响84-87
• 1.5 第一部分小结87
• 2. HPV杂合颗粒单克隆抗体的筛选及性质鉴定87-95
• 2.1 单抗细胞株的筛选及稳定单克隆细胞株的获得87-88
• 2.2 单抗基本性质鉴定88-94
• 2.3 第二部分小结94-95
• 3. HPV杂合VLP表位的预测95-105
• 3.1 单抗2B3可变区同源模建95-96
• 3.2 HPV杂合VLP同源模建96-98
• 3.3 Ramachandran plot评估98-99
• 3.4 Profile-3D分析99-100
• 3.5 单抗2B3-Fab与2个五聚体的分子对接100
• 3.6 对接结果分子间氢键分析100-101
• 3.7 对接结果溶剂可及表面分析101-103
• 3.8 单抗2B3识别表位的预测103-104
• 3.9 第三部分小结104-105
• 第四章 讨论105-113
• 1. 消减免疫方案的摸索105-108
• 1.1 环磷酰胺作用原理105
• 1.2 佐剂使用的分析105-106
• 1.3 耐受原剂量的分析106
• 1.4 环磷酰胺剂量的分析106-107
• 1.5 消减次数的分析107
• 1.6 消减免疫效果评价107-108
• 2. HPV杂合VLP的结构108-109
• 3. HPV杂合VLP表位的研究109-111
• 4. HPV杂合VLP在疫苗中的应用111-113
• 小结与展望113-114
• 参考文献114-124
• 致谢124-125
• 附录125

【参考文献】

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1 任正忠,褚小玲,狄梅,张红,朱宇,戴凌,祁雅慧,殷红,赫翠珍,姚庆英,高天祥;采用PCR技术对CO_2激光治疗尖锐湿疣烟雾中HPV，

本文编号：643659