乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原的克

发布时间：2017-08-10 22:23

  本文关键词：乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原的克隆、表达及抗体制备

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【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis virus B)即乙肝病毒(HBV)，属DNA病毒，是一种嗜肝病毒，为有包膜的部分双链环状DNA病毒。乙型病毒性肝炎（简称乙肝）的传染方式主要通过输血、注射和母婴传播。乙肝病毒(HBV)感染是世界性的难题，全球范围内慢性感染者多达4亿，发展中国家是乙型肝炎的重灾区。乙型肝炎通常会造成慢性感染，可进展为肝硬化乃至肝细胞癌，对人类健康有巨大的威胁。共价闭合环状脱氧核糖核酸(covalenfly closed circular DNA)即cccDNA，它是乙型肝炎病毒(HBV)复制中的重要环节，是mRNA和前基因组RNA的合成模板，也是HBV难以治愈的关键因素，其长期存在与乙肝的慢性化以及抗病毒治疗后复发有着重要关系。故做好cccDNA的检测工作对于了解患者病情变化、评估治疗效果有着十分重要的意义。但肝组织内cccDNA的检测需要做肝组织活检，患者往往难以接受，所以寻找一种操作方便，灵敏度高的血清学标志很有必要。随着对乙肝病毒血清标志物研究的深入，乙肝病毒核心抗原相关抗原(Hepatitis B core—related antigen，HBcrAg)逐渐进入人们的视线，人们认识到了检测血清中HBcrAg在HBV感染的监测及治疗中所具有的重要临床意义。 HBcrAg由HBcAg、HBeAg与P22cr（22kDa precore protein）三种蛋白质组成（图1），其均由前C/C区编码。C基因编码的149个氨基酸序列为它们所共享。P22cr包含第28至最少第150个氨基酸序列，是前核心区编码的蛋白，它包括N端一段未剪切的信号肽但缺少C末端富含精氨酸的片段。P22cr常存在于空缺的、不含病毒核心的病毒颗粒。 要对HBcrAg进一步研究，建立检测HBcrAg的检测方法则是必须的。因此建立双抗体夹心的ELISA方法检测HBcrAg成为迫切需要，故获取HBcrAg的相关抗体成为目前的首要任务。本课题拟表达HBcAg、HBeAg、P22cr蛋白及表达这三种蛋白所共享的149个氨基酸所组成的蛋白（我们命名为1149蛋白）。然后以HBcAg中149183这段多肽制备能特异检测HBcAg的多克隆抗体，以HBeAg中10至1这段多肽制备能特异检测HBeAg的多克隆抗体，以P22cr蛋白中28至10这段多肽制备能特异检测P22cr的多克隆抗体。1149蛋白作为免疫原来制备相应的多克隆抗体及单克隆抗体。这些抗体的制备将为今后研究HBcrAg奠定基础，同时为乙肝血清学检测的研究扩展了方向。 本研究应用分子生物学技术成功表达了HBcAg的重组蛋白、HBeAg的重组蛋白及P22cr重组蛋白，并制备了这三种蛋白中特异片段的多肽。然后在这个基础上制备了多克隆抗体且建立了能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，主要结果如下：①根据GenBank公布的核苷酸序列，，我们设计了HBcAg、HBeAg、P22cr及1149蛋白的PCR引物，运用PCR技术以含HBV全基因片段的质粒（HBV BJ）为模板，成功克隆了编码HBcAg、HBeAg、P22cr及1149蛋白的基因片段，随后成功构建了这四种蛋白的pGEX4T1原核表达载体，构建的原核表达载体pGEX4T1用Nde I和Xho I进行了双酶切，电泳可见到与理论位置相一致的条带，说明表达载体构建成功。②经过一系列尝试，得到最优诱导条件，在37℃，IPTG0.8mM/L，诱导了3.5小时，成功地在原核系统中高效表达，并纯化了目的蛋白，经Western blot证明了目的蛋白的正确性。③人工合成了实验所需的3种多肽，并经过高效液相色谱法及质谱法检测证实多肽制备正确。通过ELISA方法，我们发现HBcAg及P22cr对应多肽能够与患者血清中对应抗体结合，说明患者体内存在能够检测到这两种多肽抗原表位的抗体。④每种多肽分别偶联匙孔血蓝蛋白(KLH)，制备三种免疫原，每种免疫原分别免疫两只实验级日本大耳白兔。经过五次免疫后制备出高效价的抗体，并通过Western blot检测及ELISA方法证实制备的多抗可与目的蛋白发生特异性结合。⑤以1149蛋白为抗原免疫4只Balb/C小鼠，用血清筛选后选取抗体效价较好的小鼠用于细胞融合，融合后经有限稀释法筛选出4株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（1B8G12A12、4A3B4E6、2C6C8C5、2D7H2A6）继而制备纯化后的抗体。最后用Western blot及ELISA进行验证，证实了我们制备的单克隆抗体能与目的蛋白发生特异性的结合。 本课题成功构建了HBcrAg的原核表达载体，并诱导表达目的蛋白，制备出具有高效价、高特异性和良好抗原结合能力的多克隆抗体与单克隆抗体，为进一步研究HBcrAg,建立高特异性、高敏感性的检测方法奠定了良好的基础，对监测乙型肝炎患者病情、预后及评价治疗效果具有一定意义及应用前景。
【关键词】：乙型肝炎病毒 HBcrAg cccDNA 原核表达 多克隆抗体 单克隆抗体
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.21;R392
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文缩略词表9-11
• 前言11-13
• 第一部分 乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原的克隆、表达13-36
• 一、实验材料13-18
• 二、实验方法18-24
• 三、实验结果24-34
• 四、讨论34-36
• 第二部分 乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原多克隆抗体及单克隆抗体的制备36-57
• 一、实验材料36-39
• 二、实验方法39-47
• 三、实验结果47-55
• 四、讨论55-57
• 参考文献57-60
• 综述 乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原的研究近况60-67
• 参考文献63-67
• 附录67-68
• 致谢68-69

【参考文献】

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本文编号：653001