内质网应激反应在脂肪基质细胞体外诱导分化为神经元过程中的作用

发布时间：2017-08-13 01:14

  本文关键词：内质网应激反应在脂肪基质细胞体外诱导分化为神经元过程中的作用

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【摘要】：目的研究在脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells, ADSCs）诱导分化为神经元过程中诱导后细胞内是否存在内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）及其作用，探讨在ADSCs诱导分化为神经元细胞过程中内质网应激与caspase依赖型细胞凋亡的关系，从而为提高诱导反应效率和增加诱导后细胞的数量，以及延长其存活时间奠定基础，并为进一步的临床药物筛选和细胞移植提供理论依据。 方法1）体外分离、培养ADSCs，倒置相差显微镜下观察ADSCs生长过程中的形态学变化并计算第2代ADSCs的细胞分化率。2）应用还原剂β-巯基乙醇对传至第3~6代ADSCs进行诱导，按照诱导时间的不同分为未诱导组、预诱导组、诱导后1h、3h、5h、8h组，应用倒置相差显微镜观察各组细胞的形态学变化。3）免疫细胞化学法检测未诱导ADSCs及诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein94，GRP94)、内质网应激相关凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(transcription factor C/EBP homologous protein，CHOP)和细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达。4）Western-blotting检测诱导未诱导ADSCs及诱导后细胞NSE、GRP94、CHOP、Caspase-3的表达。5）透射电子显微镜观察ADSCs诱导分化为神经元过程中内质网的超微结构变化特征。6）MTT比色法检测未诱导ADSCs及ADSCs诱导分化为神经元过程中各组存活细胞OD值。 结果1）ADSCs悬液于48小时后完全贴壁，细胞贴壁后形态多样，呈长梭形、短梭形、类圆形或不规则形。原代培养第3天细胞开始增殖，形态逐渐趋于一致。第10~14天细胞已达到70%~80%融合，此时细胞进行传代。2）ADSCs传代第2代培养第7天时的细胞分化率为3.00±0.70%。预诱导组的细胞分化率为4.80±0.84%，细胞伸出短小突起,部分细胞漂浮死亡。在正式诱导反应1h，细胞分化率为63.40±1.14%，细胞核变大变圆，细胞质回缩，细胞体周围伸出类似神经元轴突样的长突起。诱导3h时的细胞分化率为72.60±0.89%，细胞质折光性增强，，细胞外可见明显光晕，细胞的突起进一步伸长。诱导5h时的细胞分化率达到88.20±0.83%，细胞折光性进一步增强，有些细胞突起的末端出现分支，类似于树突，同时细胞彼此连接交织成网状，细胞形态呈典型神经元形态。诱导8h时细胞分化率为86.4±1.82%，与5h时无统计学差异（P0.05），细胞形态与5h也无明显变化。3）NSE在未诱导组就可见阳性表达细胞，在细胞浆和突起部位均呈阳性表达，诱导5h的细胞阳性表达率明显高于1h、3h（P0.05），但与诱导8h的细胞阳性表达率无统计学差异（P0.05）。GRP94在未诱导组、预诱导组、诱导1h、3h、5h、8h均可见阳性细胞表达，阳性表达部位在细胞浆和突起，细胞阳性表达率逐渐降低（P0.05），但5h与8h之间没有统计学差异（P0.05）。CHOP在未诱导组、预诱导组、诱导1h、3h、5h、8h组均可见阳性细胞表达，细胞阳性表达率逐渐增加（P0.05），阳性表达部位位于细胞核、细胞核周围和突起的细胞浆，并且在细胞核的阳性表达程度明显高于在细胞核周围和细胞突起部位。Caspase-3在未诱导组、预诱导组、诱导1h、3h、5h、8h均可见阳性表达细胞，而且细胞阳性表达率明显逐渐增加（P0.05），阳性表达部位主要位于细胞体和突起的细胞质部位，细胞体的阳性表达程度明显高于细胞突起部位。4）NSE在未诱导组、预诱导组、诱导1h、3h、5h、8h的表达水平明显逐渐增加（P0.05），但诱导5h与8h组没有统计学差异（P0.05）。GRP94的表达水平在未诱导组、预诱导组、诱导1h、3h、5h、8h组明显逐渐降低（P0.05），但未诱导组与预诱导组无明显统计学差异（P0.05）。CHOP在未诱导组、预诱导组，诱导1h、3h、5h、8h组的表达水平明显逐渐增加（P0.05），至8h达到高峰，各组之间比较均有统计学差异。Caspase-3在未诱导组、预诱导组，诱导1h、3h、5h、8h组的表达水平明显逐渐增加（P0.05），至8h达到高峰，但5h与8h组无统计学差异（P0.05）。5）在透射电子显微镜下可以见到ADSCs诱导分化为神经元过程中5h组的神经元细胞质内有正常平行排列及非平行排列的粗面内质网和尼氏小体。在部分神经元细胞的细胞质内还可见粗面内质网轻至中度扩张，甚至可见内质网重度肿胀扩张，空泡状改变以及脱颗粒现象，细胞核形状不规则，染色质浓缩呈块状并高度凝聚、边缘化而核膜完整。6）存活细胞的吸光度值在未诱导组，预诱导组，诱导1h，3h，5h，8h组逐渐减低，至8h达到最低（P0.05）。 结论在ADSCs诱导分化为神经元过程中，UPR明显受到抑制，而细胞凋亡的内质网信号传导通路的活性明显增强，导致细胞凋亡所致细胞死亡数量显明增加，细胞的内质网应激途径的凋亡反应是引发诱导反应过程中细胞死亡重要原因之一。
【关键词】：脂肪基质细胞 诱导分化 神经元 内质网应激 GRP94 CHOP Caspase-3 凋亡
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.28
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-44
• 1.1 材料与方法13-25
• 1.1.1 材料13-17
• 1.1.2 实验方法17-25
• 1.2 结果25-37
• 1.2.1 ADSCs 原代及传代细胞的形态学特征25
• 1.2.2 ADSCs 体外诱导分化为神经元过程中的细胞形态学特征及各组 细胞的分化率25-32
• 1.2.3 ADSCs 诱导分化为神经元过程中 NSE/GPR94/CHOP/Caspase-3 的免疫细胞化学检测结果32-33
• 1.2.4 ADSCs 诱导分化为神经元过程中 NSE/GRP94/CHOP/Caspase-3 的 Western blotting 检测结果33-36
• 1.2.5 ADSCs 诱导分化为神经元过程中细胞内质网的超微结构特征36
• 1.2.6 诱导反应过程中细胞生长状态的 MTT 法检测结果36-37
• 1.3 讨论37-40
• 1.4 结论40
• 参考文献40-44
• 第2章 综述 内质网应激与细胞凋亡44-52
• 2.1 内质网应激44-47
• 2.1.1 内质网应激的概念和功能44-45
• 2.1.2 内质网应激的起始-未折叠蛋白反应的触发45
• 2.1.3 内质网应激的启动者-分子伴侣 GRP78/Bip45-46
• 2.1.4 PERK 介导的生存信号途径46
• 2.1.5 IRE1 信号生存通路46-47
• 2.2 内质网应激途径诱发的细胞凋亡47-48
• 2.2.1 CHOP/GADDl53 转录激活47-48
• 2.2.2 c-jun 氨基末端激酶途径诱导的细胞凋亡48
• 2.2.3 Caspase-12 的激活48
• 2.3 结语48-49
• 参考文献49-52
• 致谢52-53
• 导师简介53-54
• 作者简介54-55
• 学位论文数据集55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 ;Ultrastructure of neuronal-like cells differentiated from adult adipose-derived stromal cells[J];Neural Regeneration Research;2010年19期

2 ;Apoptosis during β-mercaptoethanol-induced differentiation of adult adipose-derived stromal cells into neurons[J];Neural Regeneration Research;2011年10期

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5 欧亚;元小冬;蔡亚楠;陆艳卉;;ADSC源性神经干细胞向神经元和星形胶质细胞不同方向分化时的超微结构变化研究[J];中国病理生理杂志;2011年07期

6 赵黔鲁,柴锡庆;鱼藤酮诱发PC12细胞内质网应激的钙机制和超微结构的变化[J];中华神经科杂志;2005年06期

本文编号：664632