PIF1解螺旋酶在DNA损伤修复中的作用

发布时间：2017-08-14 11:11

  本文关键词：PIF1解螺旋酶在DNA损伤修复中的作用

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【摘要】：目的：利用PIF1敲低细胞系，研究PIF1蛋白与细胞周期及辐射应答之间的关系；构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端PINT结构域（PIF1N）截短体真核表达重组质粒，，进行真核表达，并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位；设计能抑制PIF1的SiRNA序列，构建SiRNA真核表达载体，鉴定为下一步实验做准备；DR-GFP-U2OS细胞模型双键断裂损伤后，分别敲低、过表达PIF1、及其C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端PINT结构域（PIF1N）。检测绿荧光变化。明确PIF1在DNA双链断裂损伤中同源重组修复中的作用。 方法：HeLa细胞经TDR双阻断后，不同时间点收细胞，流式细胞仪检测细胞周期同步化时相，Westernblot检测PIF1蛋白的变化。HeLa细胞进行60Coγ射线不同剂量照射，按时间点收细胞，Western blot检测PIF1蛋白的变化水平；PIF1敲低细胞系及对照组细胞经TDR双阻断后，分别在不同时间点收细胞，流式细胞仪检测周期各时相细胞所占比例。PIF1敲低细胞系及对照组细胞分别进行4、20Gy照射，照射后分别在0、24h、48h收细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况；以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag2B质粒中构建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒；通过lipofectamine2000将重组质粒转染人293细胞中，Western blot方法检测其在真核细胞内的表达，用免疫荧光的方法检测其细胞内定位；将设计好的抑制PIF1的SiRNA序列送公司合成后，Western blot检测，确定敲低序列；将低敲的PIF1siRNA、过表达的PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒通过lipofectamine2000分别转入DR GFP U2OS细胞中，24h后再分别转入I-SceI的表达质粒，48h后检测绿荧光蛋白的强度变化。 结果：双阻断后，PIF1蛋白的含量在S期显著升高。进行60Coγ射线照射后，各剂量PIF1蛋白均有先下降后升高的趋势，2Gy在2h左右蛋白含量下降，4h左右开始升高，，4Gy在2h左右蛋白含量下降，6h左右开始升高，10Gy在2h左右蛋白含量下降，10h左右开始升高；敲低细胞系在G2/M期的含量明显高于对照组，照射后，敲低组细胞凋亡率48h内明显升高；成功构建PIF1及其截短体真核表达重组体，并在真核细胞内成功表达。确定PIF1定位于整个细胞，呈弥散状分布，PIF1解螺旋酶模序主要定位于胞浆中，PIF1PINT结构域主要定位于核周；成功构建了抑制PIF1的SiRNA，并在真核细胞中成功表达；敲低组PIF1的绿荧光强度低于对照组，敲低又过表达PIF1的绿荧光强度较敲低组略有升高，PIF1、PIF1C、PIF1N的绿荧光强度高于对照组，但PIF1、PIF1N的荧光强度相近且高于PIF1C。 结论：1.PIF1在细胞周期S期表达量升高，可能与细胞的复制有关。2.PIF1影响细胞周期的G2/M期进程，敲低PIF1细胞周期变慢。3.PIF1调控辐射诱导的细胞凋亡，与辐射应答有关，敲低PIF1导致细胞凋亡率升高。4.真核细胞中成功表达了PIF1、PIF1C、PIF1N，且发现PIF1的PINT结构域对PIF1的入核起重要作用。5.PIF1、PIF1的PINT功能域和解螺旋酶序对DSBs的同源重组修复都有一定的作用，但PIF1的PINT结构域起重要作用。
【关键词】：解螺旋酶 PIF1 重组质粒 蛋白表达 免疫荧光 流式细胞术
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 目录8-9
• 主要英文缩略语索引9-10
• 前言10-14
• 材料与方法14-25
• 1. 材料14-18
• 2．实验方法18-24
• 3.统计学分析24-25
• 结果25-37
• 1.同步化 HeLa 细胞后 PIF1 蛋白在 S 期明显升高25-26
• 2.不同剂量γ射线照射 HeLa 细胞后 PIF1 蛋白的产生和量变时间效应26-27
• 3.PIF1 敲低减缓细胞周期进程27-28
• 4.PIF1 敲低导致电离辐射诱导的细胞凋亡升高28-30
• 5.过表达 PIF1 及其截短体重组质粒的构建30-33
• 6.敲低 PIF1 蛋白的 SiRNA 的鉴定33-34
• 7.PIF1 蛋白对绿荧光蛋白的荧光强度的影响34-37
• 讨论37-40
• 结论40-41
• 参考文献41-43
• 文献综述43-54
• 参考文献47-54
• 致谢54-55
• 作者简介55-57
• 导师评阅表57

【参考文献】

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1 Frank GROSSE;Multiple Functions of Nuclear DNA Helicase Ⅱ (RNA Helicase A) in Nucleic Acid Metabolism[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年03期

本文编号：672339