Angiopep-2修饰的脑靶向基因传递载体的研究

发布时间：2017-08-16 12:27

  本文关键词：Angiopep-2修饰的脑靶向基因传递载体的研究

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【摘要】：随着分子生物学的发展与科学技术的进步，基因治疗逐渐成为各种中枢神经系统疾病的新型治疗方法。如何跨越血脑屏障，将治疗基因有效递送到脑中病变部位，是一个亟待解决的关键问题。安全性好、转染效率高且不受体内环境干扰，能有效通过血脑屏障，理想的脑靶向基因传递载体必须同时满足上述要求。 本课题将PEI/DNA复合物与脂质体联合使用，制备得到脂质体、PEI、DNA的三元复合物，并在复合物上连接PEG和脑靶向肽Angiopep-2，使复合物具有脑靶向的功能。 首先对制备PEI/DNA复合物的相关影响因素（制备溶剂PH、离子强度、制备温度、复合比例等）进行系统考察，通过对复合物粒径、表面电位等理化性质研究，确定了得到较小粒径PEI/DNA复合物的制备条件，即室温下、溶剂PH在3～7、离子强度小于0.02mol/L、PEI与DNA复合比例（N/P）为4～10。随后选择在基本符合上述条件的三种溶剂体系中制备PEI/DNA复合物，MTT法检测复合物的细胞毒性，并用pGL-3质粒评价复合物在Hela细胞中的转染效率，最终确定了以去离子水作为溶剂、N/P为8的条件下制备PEI/DNA复合物。 在此基础上，将脂质体加入PEI/DNA形成三元复合物，以期降低PEI的毒性。通过对复合物的粒径、表面电位、细胞毒性及转染效率的检测，可制备得到粒径小于200nm、电位20mV左右的pCaLip/PEI/DNA三元复合物，该复合物具有较高的转染效率和良好的安全性，且在10%血清存在条件下其转染效率不受影响。 随后进一步将脑靶向肽Angiopep-2与PEG化的磷脂共价连接，经核磁共振确证连接。制备脑靶向三元复合物，粒径、电位分别为180nm、15mv。MTT法检测其具有较好的安全性，细胞存活率90%以上。细胞转染结果表明，靶向复合物与未经靶向修饰的复合物相比，在阳性细胞hCMEC/D3和C6细胞中的转染显著提高（P0.05），而在阴性细胞Hela中无明显变化。建立人大脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）BBB细胞模型，，并在该模型上考察三元复合物的血脑屏障透过性。结果表明本文制备的脑靶向三元复合物能够有效促进质粒透过血脑屏障细胞模型。用上述脑靶向三元复合物携载TRAIL质粒考察其对BBB模型下层C6细胞的杀伤作用，结果显示与未经靶向修饰的载体组相比其具有更显著的肿瘤细胞杀伤效果。 综上所述，本文成功制备了Angiopep-2修饰的脂质体/PEI/DNA三元复合基因传递载体，体外研究表明该载体具有较好的安全性和较高的转染效率，能够成功透过血脑屏障模型，是一种有潜力的脑靶向基因传递载体。
【关键词】：脑靶向 Angiopep-2 PEI 脂质体 基因传递
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416;R450
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 前言12-23
• 1.1 基因治疗概述12-13
• 1.2 非病毒载体的种类13-17
• 1.2.1 阳离子多聚物载体13-16
• 1.2.2 阳离子脂质体（脂质复合物）载体16-17
• 1.2.3 非病毒载体的联合使用17
• 1.3 脑靶向传递系统17-21
• 1.3.1 血脑屏障（BBB）17-19
• 1.3.2 脑靶向纳米传递载体19-21
• 1.4 本文立题依据及实验设计21-23
• 第二章 实验材料和方法23-33
• 2.1 材料、试剂及仪器23-25
• 2.1.1 材料23-24
• 2.1.2 所用主要试剂24
• 2.1.3 仪器和设备24-25
• 2.2 实验方法25-33
• 2.2.1 质粒转化及提取25
• 2.2.2 质粒的质量测定25-26
• 2.2.3 PEI/DNA 复合物相关影响因素考察26-28
• 2.2.4 脂质体与 PEI/DNA 三元复合物制备及性质考察28-29
• 2.2.5 脑靶向三元复合物制备及表征29-32
• 2.2.6 统计学分析32-33
• 第三章 结果与讨论33-55
• 3.1 PEI/DNA 的制备及性质考察33-38
• 3.1.1 溶剂 PH 值对 PEI/DNA 复合物制备的影响33-34
• 3.1.2 溶剂离子强度对 PEI/DNA 复合物制备的影响34
• 3.1.3 温度对 PEI/DNA 复合物制备的影响34-35
• 3.1.4 N/P 对 PEI/DNA 复合物制备的影响35-38
• 3.1.5 小结38
• 3.2 脂质体/PEI/DNA 三元复合物的制备及性质考察38-43
• 3.2.1 脂质体荷电对三元复合物制备的影响38-40
• 3.2.2 PEG 修饰对三元复合物制备的影响40-42
• 3.2.3 血清对复合物转染效率的影响42-43
• 3.2.4 小结43
• 3.3 脑靶向脂质体/PEI/DNA 复合物的制备43-49
• 3.3.1 肽的靶向性评价44-45
• 3.3.2 DSPE-PEG2000-ANG 的合成及表征45-46
• 3.3.3 脑靶向三元复合物的制备及理化性质考察46-47
• 3.3.4 脑靶向三元复合物的转染效率和细胞毒性考察47
• 3.3.5 小结47-49
• 3.4 脑靶向三元复合物的 BBB 通透性考察49-55
• 3.4.1 体外 BBB 细胞模型的建立49-50
• 3.4.2 各种复合物在 BBB 模型上的透过能力考察50-53
• 3.4.3 各种复合物携载治疗基因对 C6 细胞的杀伤作用考察53-54
• 3.4.4 小结54-55
• 全文总结55-56
• 参考文献56-61
• 作者简介、发表论文和科研情况说明61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 卢韵;姚静;周建平;王伟;邓祖媛;关丽叶;;聚乙烯亚胺-DNA复合物的形成和聚集行为研究[J];药学学报;2009年06期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 马士淇;靶向鼻咽癌细胞的壳聚糖复合纳米基因载体的研究[D];吉林大学;2012年

2 韩晓琳;氢溴酸加兰他敏鼻腔给药脑靶向传递系统的研究[D];北京化工大学;2009年

本文编号：683287