VWF-A1的表达纯化及其在力学环境中的功能研究

发布时间：2017-08-16 22:24

  本文关键词：VWF-A1的表达纯化及其在力学环境中的功能研究

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【摘要】：在循环血流中，血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）通过介导高速流动的血小板在血管内壁受损部位的粘附，在初始止血过程中起着至关重要的作用，是连接血小板与血管内皮下胶原的桥梁。其中血小板的初始粘附依赖于VWF的A1结构域与血小板表面糖蛋白受体（platelet glycoprotein Ibα，GPIbα）的相互作用，并在该过程中会伴随着胞内钙信号的传导，进而刺激白细胞上整合素的激活，并引起血小板的稳定粘附和聚集。鉴于VWF-A1与血小板GPIbα的相互作用在凝血止血方面的重要性，本文以VWF-A1分子与血小板作为研究对象，平行平板流动腔作为研究手段，研究在不同剪应率条件下VWF-A1分子与血小板GPIbα的相互作用以及血小板的激活水平，从而对于在正常生理条件下的血流剪应力如何经由GPIbα/VWF-A1来介导血小板的活化，进而发挥止血功能有更深入的认识。 首先，通过探索目的蛋白表达条件，并通过比较两种不同的裂菌方法：溶菌酶破碎法及超声波破碎法，，使目的蛋白能高效地以可溶性形式表达；进而经过Ni柱亲和层析纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化蛋白的特异性及其纯度，每100ml上清液可纯化得到5.77mg VWF-A1纯品，并具有较高的纯度。 然后，采用流动腔实验系统检测其生物学功能。将纯化的血小板（取自健康志愿者）以不同的流体剪切力（1~20dyn/cm2）灌注到底板做不同处理（分别铺有BSA、PBS及100μg/ml的VWF-A1蛋白）的流动腔中。通过对比实验，证实了血小板的粘附是由GPIb与VWFA1之间的特异性相互作用所介导的。从实验结果可知，1%BSA能够有效阻断血小板与底板间的非特异性粘附，但不影响与VWF-A1间的特异性相互作用，因而后续实验均采用此方法来进行流动腔底板功能化。 最后，仍然采用流动腔作为研究手段，通过将纯化的血小板上染上荧光染料Fluo4-AM，该染料在有钙离子的刺激时则会发生反应，即可观测到荧光现象。再将其与其他血细胞混合后以不同流体剪切率（50~500s-1）灌注到底板经功能化处理（含有1%BSA的120μg/ml的VWF-A1蛋白）的流动腔中。为验证血小板的钙响应事件是否具有力的依赖性，以及在不同剪应率条件下血小板的激活水平，我们通过分析相对荧光强度的变化来分析激活比率、激活时间、达峰时间、半衰期及相对峰值等参数来探讨上述问题。实验结果表明，血小板的激活的确具有力依赖性，此外我们还发现血小板的激活是由高剪切率所介导，随着剪切率的增大，会呈现激活时间缩短、达峰更快、半衰期更短以及相对荧光强度增强的趋势。
【关键词】：VWF-A1 血小板 纯化 流动腔 剪切率 相对荧光强度
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R331
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目录9-12
• 第一章 绪论12-25
• 1.1 血管性血友病及其研究现状12-14
• 1.1.1 血管性血友病的临床表现及发病机理12
• 1.1.2 血管性血友病的分型12-14
• 1.2 血管性血友病因子的研究进展14-19
• 1.2.1 血管性血友病因子的合成与分泌14-15
• 1.2.2 血管性血友病因子的分子结构15-16
• 1.2.3 血管性血友病因子各结构域的结构及功能16-19
• 1.3 国内外研究现状19-23
• 1.3.1 VWF-A1 与血小板相互作用的研究进展19-21
• 1.3.2 利用流动腔研究单分子对在流体剪应力下的相互作用21-23
• 1.4 科学问题的提出及论文的主要内容23-25
• 1.4.1 科学问题的提出23-24
• 1.4.2 论文研究的主要内容24
• 1.4.3 论文的结构安排24-25
• 第二章 VWF-A1 分子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化25-41
• 2.1 实验材料25-28
• 2.1.1 质粒与菌种25
• 2.1.2 试剂与耗材25
• 2.1.3 实验仪器及设备25-26
• 2.1.4 实验相关溶液的配制26-28
• 2.2 实验方法28-35
• 2.2.1 质粒转化大肠杆菌感受态细胞28
• 2.2.2 质粒小提28-29
• 2.2.3 提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞29
• 2.2.4 挑单克隆菌株及扩大培养29-30
• 2.2.5 两种方法探索目的蛋白 VWF-A1 的可溶性表达30-31
• 2.2.6 VWF-A1 的纯化31-32
• 2.2.7 12 % SDS-PAGE 鉴定亲和层析纯化的 VWF-A1 的纯度32-33
• 2.2.8 Western-blot 测定纯化产品的免疫活性33-34
• 2.2.9 BCA 试剂盒对目的蛋白定量34-35
• 2.3 实验结果35-39
• 2.3.1 两种方法诱导 VWF-A1 的可溶性表达35-36
• 2.3.2 SDS-PAGE、Western-blot 鉴定亲和层析纯化的结果36-38
• 2.3.3 目的蛋白的定量结果38-39
• 2.4 讨论39-40
• 2.5 本章小结40-41
• 第三章 VWF-A1 与血小板结合的功能鉴定41-49
• 3.1 实验材料41-43
• 3.1.1 血小板与蛋白分子41
• 3.1.2 试剂与耗材41
• 3.1.3 实验仪器及设备41-43
• 3.2 实验方法43-45
• 3.2.1 血小板的提取与纯化43-44
• 3.2.2 平行平板流动腔实验准备44
• 3.2.3 VWF-A1 与血小板的特异性相互作用44-45
• 3.3 实验结果45-47
• 3.4 讨论47-48
• 3.5 本章小结48-49
• 第四章 VWF-A1 在力学环境下介导的血小板钙信号激活49-62
• 4.1 实验材料49-51
• 4.1.1 血小板与蛋白分子49
• 4.1.2 试剂与耗材49
• 4.1.3 实验仪器及设备49-50
• 4.1.4 实验相关溶液的配制50-51
• 4.2 实验方法51-55
• 4.2.1 血样的准备51-52
• 4.2.2 平行平板流动腔实验准备52
• 4.2.3 VWF-A1 介导的血小板钙信号激活的流动腔实验52-55
• 4.3 实验结果55-59
• 4.3.1 血小板钙信号的激活具有力的依赖性55-56
• 4.3.2 在力学环境下血小板钙信号激活的不同类型56-57
• 4.3.3 流体剪切率调控血小板钙信号激活时间57-58
• 4.3.4 流体剪切率调控血小板钙信号激活水平58-59
• 4.4 讨论59-61
• 4.5 本章小结61-62
• 总结与展望62-64
• 参考文献64-72
• 攻读硕士期间取得的研究成果72-73
• 致谢73-74
• 附件74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 吕守芹;杨帆;龙勉;;细胞-分子生物力学研究进展[J];医用生物力学;2009年02期

2 杨小芳;丁孝茹;吴建华;方颖;;vWF-A1A2A3介导循环血小板翻滚运动的机制研究[J];医用生物力学;2013年05期

本文编号：685873