蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂筛选模型的构建及应用

发布时间：2017-08-17 15:41

  本文关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂筛选模型的构建及应用

  更多相关文章： SHP-1 抑制剂 高通量筛选 J11310 糖尿病 葡萄糖消耗 AMPK IRS

【摘要】：蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs）是细胞信号转导中的重要调节因子，与人类疾病密切相关。SHP-1是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家族中的重要成员，研究表明，PTPs与糖尿病患者血糖控制以及糖尿病血管并发症关系密切。寻找蛋白酪氨酸磷酸酶的高活性抑制剂对糖尿病和肥胖症治疗有着广阔的应用前景。 本课题我们从人脑组织中获取mRNA，通过RT-PCR扩增出目标cDNA，构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重组质粒。将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中，筛选阳性克隆进行验证，将测序正确的质粒转化到E.coli Transetta感受态细胞中表达SHP-1，获得具有生物活性的体外重组SHP-1蛋白。同时对表达条件进行了优化，结果表明20℃，0.4mmol/L IPTG对表达菌株进行诱导时，SHP-1在体外高效稳定的表达。采用我们体外表达获得的蛋白建立SHP-1高通量筛选模型，对多种化合物用SHP-1抑制剂筛选模型进行筛选，寻找高活性的蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂，结果获得活性化合物J11310。 实验中以人肝癌细胞株HepG2细胞和大鼠骨骼肌成肌L6细胞为研究对象，选用胰岛素30nM作为阳性对照对照，评价了J11310对细胞糖代谢的影响。结果表明，样品J11310对HepG2细胞和L6细胞无毒性，可剂量依赖性的促进HepG2和L6细胞葡萄糖消耗，当浓度为1μg/mL时能显著性促进细胞葡萄糖消耗。提示样品J11310的作用机制可能是通过促进肝脏和外周对葡萄糖的利用起到降葡萄糖作用。在HepG2细胞中加入胰岛素，控制样品的有无，以罗格列酮10-5M为阳性对照，比较细胞葡萄糖消耗量以评价样品有无胰岛素的协同作用。结果显示，J11310在HepG2细胞中有较好的胰岛素协同性，作用强于罗格列酮，以1μg/mL作用最强，随着浓度降低，样品对葡萄糖消耗的协同作用逐渐减弱，在10-4μg/mL，10-5μg/mL时无协同作用。用不同浓度四氧嘧啶对RINm5F细胞进行损伤，样品不同浓度的J11310均对损伤的胰岛细胞RINm5F无保护作用。用细胞免疫荧光方法检测细胞中PGC-1α、Pi-AMPK、Pi-IRS的表达量，结果显示，样品J11310与HepG2细胞作用后，磷酸化AMPK以及磷酸化IRs表达量增加，对PGC-1a的表达量无明显影响。这提示，J11310可能通过激活AMPK活性发挥葡萄糖脂代谢调控作用，同时还提高了IRS磷酸化水平，继而激活下游胰岛信号的传递，促进血液中葡萄糖向细胞内的转运而降低血糖含量。 以上研究工作为进一步寻找发现SHP-1的高活性抑制剂，和评价化合物生物活性打下了基础。同时为寻找治疗糖尿病和肥胖症的药物提供新的研究思路，，有着重要的研究价值和应用前景。
【关键词】：SHP-1 抑制剂 高通量筛选 J11310 糖尿病 葡萄糖消耗 AMPK IRS
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416;R587.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 目录8-11
• 前言11-21
• 参考文献17-21
• 第一章 蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP-1 基因克隆与表达21-29
• 1. 实验材料21
• 1.1 菌株与主要试剂21
• 1.2 主要仪器21
• 2. 实验方法21-23
• 2.1 人 SHP-1 全长基因的克隆21-22
• 2.2 重组质粒 SHP-1-pEASY-E1 的构建及鉴定22
• 2.3 重组质粒在原核细胞中的表达及鉴定22-23
• 3. 实验结果23-25
• 3.1 人源 SHP-1 cDNA 全长的克隆23
• 3.2 重组质粒 SHP-1-pEASY-E1 的筛选与鉴定23-24
• 3.3 SHP-1 在原核细胞中的表达24
• 3.4 SHP-1 原核表达条件的优化24-25
• 4. 小结与讨论25-27
• 参考文献27-29
• 第二章 SHP-1 抑制剂筛选模型的建立与抑制剂的筛选29-37
• 1. 实验材料29-30
• 1.1 菌株29
• 1.2 试剂29
• 1.3 主要仪器29
• 1.4 主要试剂的配制29-30
• 2. 实验方法30
• 2.1 SHP-1 酶浓度测定30
• 2.2 SHP-1 酶促反应动力学分析30
• 2.3 SHP-1 抑制剂高通量筛选模型的建立30
• 2.4 筛选模型的验证与样品 J11310 对 SHP-1 抑制率的测定30
• 3. 实验结果30-32
• 3.1 SHP-1 的酶促反应动力学分析30-31
• 3.2 SHP-1 抑制剂的筛选模型31-32
• 3.3 NaVO4 对 SHP-1 的抑制作用32
• 3.4 J11310 对 SHP-1 的抑制作用32
• 4．小结与讨论32-35
• 参考文献35-37
• 第三章 酪氨酸磷酸酶抑制剂在细胞水平上降糖效果评价37-49
• 1. 实验材料37-38
• 1.1 细胞37
• 1.2 药品和试剂37-38
• 1.3 主要仪器38
• 1.4 主要试剂配制38
• 2. 实验方法38-40
• 2.1 细胞培养38
• 2.2 细胞活力的测定38-39
• 2.3 细胞葡萄糖消耗的测定39
• 2.4 胰岛素的协同作用的测定39-40
• 3．实验结果40-44
• 3.1 61 个样品浓度为 10μg/mL 时对 HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响40-41
• 3.2 J11310 对 HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响41-43
• 3.3 样品中对 HepG2 细胞胰岛素协同作用的影响43-44
• 4．小结与讨论44-47
• 参考文献47-49
• 第四章 酪氨酸磷酸酶抑制剂 J11310 降糖机制的研究49-60
• 1. 实验材料49-50
• 1.1 细胞49
• 1.2 药品和试剂49
• 1.3 主要试剂的配制49
• 1.4 主要仪器49-50
• 2. 实验方法50-52
• 2.1 细胞培养50
• 2.2 RINm5F 细胞四氧嘧啶损伤保护实验50
• 2.3 细胞免疫荧光50-51
• 2.4 细胞总 RNA 的提取及浓度测定51
• 2.5 Real-time PCR51-52
• 3. 实验结果52-56
• 3.1 J11310 对四氧嘧啶损伤 RINm5F 细胞的影响52-53
• 3.2 J11310 对 HepG2 细胞 PGC-1α，p-AMPK，p-IRS 表达量的影响53-54
• 3.3 J11310 对 HepG2 细胞中 SHP1 mRNA 表达的影响54-56
• 4. 小结与讨论56-59
• 参考文献59-60
• 致谢60-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张佳林;钟嘉明;张成钧;崔雪阳;;“永生化”胰岛β细胞系研究进展[J];生物医学工程与临床;2009年04期

2 王辰,王沥,杨泽;蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)与2型糖尿病及肥胖的关系[J];遗传;2004年06期

本文编号：689822