SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外培养方法改良

发布时间：2017-08-18 02:14

  本文关键词：SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外培养方法改良

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【摘要】：目的：通过不同的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离提取方法、首次换液时间改良SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养方法,探讨更为有效合理的SD大鼠BMSCs体外培养方法,为更进一步的相关基础及临床实验研究提供足量的干细胞源细胞。 方法：通过全骨髓贴壁法、改良全骨髓贴壁法、密度梯度离心法3种不同的方法提取SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),然后通过与接种后8h、24h2种不同的首次换液时间组合,观察和对比骨髓间充质干细胞(BMSCs)在每种组合中的形态学表现,体外培养时增殖、传代的效率,传代后BMSCs的细胞活力情况,传代后BMSCs的细胞表面标志物的表达情况,从而进行筛选体外增殖培养SD大鼠BMSCs更为合理的体外扩增模式。 结果：全骨髓贴壁法、改良全骨髓贴壁法8h首次换液时即可见少量梭形、三角或多角形细胞贴壁,而密度梯度离心法提取的细胞中仅部分培养瓶中可见极少量贴壁细胞,随着首次换液时间的推后贴壁细胞逐渐增多,至首次换液时间24h组时3种方法组均可见较多梭形、三角或多角形细胞贴壁；全骨髓贴壁法、改良全骨髓贴壁法首次传代时间7-8天,密度梯度离心法首次传代时间12-14天,前两种细胞提取方式较后者差异具有统计学意义(P＜0.05)；3种提取方法获取的细胞第三代至第八代每代细胞增殖时间约为7-8天,各组间比较差异无统计学意义。MTT法检测各组细胞生长曲线示全骨髓贴壁法组、改良全骨髓贴壁法组和密度梯度离心法组先后进入对数生长期和停滞期时间基本相同,密度梯度离心法提取组细胞传至第九代时,细胞形态发生变化,细胞增殖能力较前明显减弱甚至停滞,而全骨髓贴壁法组和改良全骨髓贴壁法组未见明显变化。取各组增殖良好的第三代大鼠BMSCs分别行台盼蓝染色和CD34、CD44细胞表面抗原检测,活细胞比例检测结果示3种细胞提取方法均可获得活力较好的BMSCs,各组之间比较无统计学意义；BMSCs细胞表面抗原表达检测结果示密度梯度离心法组和改良全骨髓贴壁法8h首次换液组表现良好,与其它3组比较具有统计学意义。 结论：全骨髓贴壁法、改良全骨髓贴壁法、密度梯度离心法3种SD大鼠骨。髓间充质干细胞(BMSCs)的提取方法均可在体外扩增培养过程中较好的展现出BMSCs特有的细胞形态,并且能在一定程度上稳定传代。全骨髓贴壁法和改良全骨髓贴壁法较密度梯度离心法贴壁效率高、首次传代时间短、持续增殖能力及细胞活力强；改良全骨髓贴壁法和密度梯度离心法较全骨髓贴壁法得到大鼠BMSCs的纯度较高。在改良全骨髓贴壁法提取大鼠BMSCs后采用全量换液方式并适当的提前首次换液时间可在不影响大鼠BMSCs体外增殖培养的效率、细胞活性的前提下提高所获得大鼠BMSCs的纯度,是一种较为适合的大鼠BMSCs的体外培养模式。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 体外培养 提取方式 换液时间
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-12
• 英文缩写词索引12-13
• 1 引言13-16
• 2 材料和方法16-23
• 2.1 实验材料16-19
• 2.1.1 实验动物16
• 2.1.2 实验器材16-17
• 2.1.3 实验主要试剂17-18
• 2.1.4 实验仪器18
• 2.1.5 试剂配制18-19
• 2.2 实验方法19-23
• 2.2.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的提取方法19-20
• 2.2.2 不同首次换液时间和日常换液及传代过程的处理20-21
• 2.2.3 SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)形态学的观察和对比21
• 2.2.4 SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞活力的观察和对比21
• 2.2.5 SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长曲线的观察和对比21-22
• 2.2.6 SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)流式细胞仪检测表面标志的结果和对比22
• 2.2.7 统计学分析和图像处理22-23
• 3 结果23-27
• 3.1 不同提取方法SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)形态学的观察对比23-24
• 3.1.1 全骨髓贴壁法23
• 3.1.2 改良细胞贴壁法23-24
• 3.1.3 密度梯度离心法24
• 3.2 不同提取方法SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的首次传代时间对比24-25
• 3.3 不同提取方法SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞活力的观察对比25
• 3.4 不同提取方法SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长曲线观察和对比25
• 3.5 不同提取方法SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)流式细胞仪检测表面标志测试结果对比25-27
• 4 讨论27-30
• 4.1 大鼠BMSCs细胞培养基的选择27-28
• 4.2 大鼠BMSCs细胞提取方法选择28-29
• 4.3 大鼠BMSCs首次换液时间的选择和首次换液方式的选择29-30
• 5 结论30-31
• 参考文献(正文)31-33
• 附图33-46
• 6 文献综述46-73
• 6.1 干细胞特性46-52
• 6.1.1 骨髓间充质干细胞46-50
• 6.1.2 神经干细胞50-52
• 6.2 干细胞制备52-53
• 6.3 基础研究53-55
• 6.4 临床研究55-62
• 6.5 临床应用62-64
• 6.5.1 神经干细胞(Neural Stem Cells)的临床应用62-63
• 6.5.2 表皮干细胞(epidermal stem cells)和毛囊干细胞(hair follicle stem cells)的临床应用63-64
• 6.5.3 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)64
• 6.6 研究面临的主要问题64-65
• 参考文献(文献综述部分)65-73
• 个人简历73-74
• 致谢74

【参考文献】

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本文编号：692202