构建和表达抗HSV-2单链抗体和碱性磷酸酶的融合蛋白

发布时间：2017-08-19 21:00

  本文关键词：构建和表达抗HSV-2单链抗体和碱性磷酸酶的融合蛋白

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【摘要】：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)分为单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)两种类型,可以感染皮肤、黏膜以及多种器官。绝大多数生殖器疱疹(genital herpes,GH)是由HSV-2感染引起,但由HSV-1感染引起的GH比例在增加。HSV-2感染目前是不可治愈的,主要通过性接触水平传播和母婴垂直传播,传染性极强且会反复发作,疱疹发作产生的溃疡是生殖器溃疡的主要病因之一,流行病学证据表明HSV-2感染与宫颈癌和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染都有密切的关系。HSV-2在人群中有着很高的感染率和发病率,世界卫生组织发布的调查数据显示2003年全球15岁至49岁年龄段人群中,HSV-2感染率约为16.2%,发病率约为0.7%,并且都有不断上升的趋势。因此,建立一种简便、快速、低成本的HSV-2初筛方法,对GH的辅助诊断和控制传播具有重要的意义。 为探索本实验室前期筛选到的特异性抗HSV-2糖蛋白B的单链抗体在GH诊断中的实用价值,本研究将该单链抗体基因克隆入原核表达载体pLac-duet-1-AKP中构建了抗HSV-2单链抗体和碱性磷酸酶的融合表达载体pLac-H3-AKP,并转入大肠杆菌BL21(DE3)获得表达,经IPTG诱导后SDS-PAGE显示在破菌沉淀中有符合预期大小的约75kD大小的新生蛋白带。将包涵体裂解后用镍离子螯合层析纯化变性的融合蛋白,并初步探索出该融合蛋白的最佳复性条件：复性缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,10mmol/L β-巯基乙醇,0.5mol/L尿素,0.5mol/L精氨酸,lmmol/L GSSG和3mmol/L GSH,pH7.5),蛋白的初始复性浓度为0.13mg/mL,4℃复性24h。复性后的融合蛋白不仅能与HSV-2糖蛋白B抗原特异结合而且具有碱性磷酸酶的指示酶活性,为快速检测HSV-2抗原提供了一种有效的方法。
【关键词】：HSV-2 单链抗体 碱性磷酸酶 融合蛋白 蛋白复性
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 缩写说明13-14
• 第一章 文献综述14-25
• 1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型与生殖器疱疹14
• 1.2 单链抗体及其应用14-16
• 1.2.1 单链抗体简介14-15
• 1.2.2 单链抗体的应用15-16
• 1.3 大肠杆菌原核表达16-17
• 1.3.1 可溶性表达及包涵体表达16-17
• 1.3.2 提高可溶性表达的方法17
• 1.4 包涵体复性17-22
• 1.4.1 包涵体的形成17-18
• 1.4.2 包涵体的可利用之处18
• 1.4.3 复性的概念18
• 1.4.4 影响复性的因素18-20
• 1.4.5 复性的主要方法20-22
• 1.5 研究计划22-25
• 1.5.1 研究内容22-23
• 1.5.2 技术路线23
• 1.5.3 拟突破难点23-24
• 1.5.4 创新点24-25
• 第二章 建立碱性磷酸酶比活标准对照25-39
• 2.1 引言25
• 2.2 实验材料25-29
• 2.2.1 菌株25-26
• 2.2.2 培养基26
• 2.2.3 主要试剂26-28
• 2.2.4 主要仪器28-29
• 2.3 实验方法29-35
• 2.3.1 pET43.1-AKP的可溶性表达29
• 2.3.2 金属螯合层析纯化AKP29-30
• 2.3.3 12%SDS-PAGE电泳30-33
• 2.3.4 AKP储存液透析AKP33
• 2.3.5 AKP比活测定33-35
• 2.4 结果与分析35-38
• 2.4.1 AKP可溶表达的定位35-36
• 2.4.2 AKP金属螯合层析纯化效果36-37
• 2.4.3 AKP比活测定37-38
• 2.4.4 比活计算38
• 2.5 小结38-39
• 第三章 融合表达载体pLac-H3-AKP的构建39-49
• 3.1 引言39
• 3.2 实验材料39-41
• 3.2.1 菌株及质粒39
• 3.2.2 培养基39-40
• 3.2.3 主要试剂40
• 3.2.4 主要仪器40-41
• 3.3 实验方法41-46
• 3.3.1. pLac-duet-1-AKP的扩增41-42
• 3.3.2 pCANTAB5E-H3的扩增42-43
• 3.3.3 两个质粒的双酶切43-44
• 3.3.4 双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳44
• 3.3.5 基因片段的凝胶回收44-45
• 3.3.6 基因片段的连接45
• 3.3.7 pLac-H3-AKP的双酶切鉴定45-46
• 3.4 结果与分析46-48
• 3.5 小结48-49
• 第四章 融合蛋白的表达49-57
• 4.1 引言49
• 4.2 实验材料49-50
• 4.2.1 主要试剂49
• 4.2.2 主要仪器49-50
• 4.3 实验方法50-52
• 4.3.1 pLac-H3-AKP表达菌的构建50
• 4.3.2 融合蛋白的可溶性表达尝试50-51
• 4.3.3 融合蛋白的包涵体表达51
• 4.3.4 包涵体的洗涤51
• 4.3.5 包涵体的变性51-52
• 4.3.6 变性融合蛋白的金属螯合层析52
• 4.4 结果与分析52-56
• 4.4.1 融合蛋白的可溶性表达52-53
• 4.4.2 融合蛋白的包涵体表达53-54
• 4.4.3 包涵体的洗涤54
• 4.4.4 变性融合蛋白的金属螯合层析54-56
• 4.5 小结56-57
• 第五章 融合蛋白的复性57-64
• 5.1 引言57
• 5.2 实验材料57-58
• 5.2.1 主要试剂57
• 5.2.2 主要仪器57-58
• 5.3 实验方法58-59
• 5.3.1 复性条件的筛选58
• 5.3.2 复性后融合蛋白的分析鉴定58-59
• 5.4 结果与分析59-63
• 5.4.1 不同pH值对复性效果的影响59
• 5.4.2 不同初始复性蛋白浓度对复性效果的影响59-60
• 5.4.3 不同GSSG/GSH比例对复性效果的影响60-61
• 5.4.4 不同时间对复性效果的影响61
• 5.4.5 8%SDS-PAGE分析61-62
• 5.4.6 抗原结合活性鉴定62-63
• 5.5 小结63-64
• 参考文献64-72
• 附录72-73
• 致谢73-74
• 攻读学位期间发表的学术论文74

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