药物性脊髓损伤动物模型制作探索及其脊髓内NSE、AchE、NFP和S-100的表达研究

发布时间：2017-08-20 07:01

  本文关键词：药物性脊髓损伤动物模型制作探索及其脊髓内NSE、AchE、NFP和S-100的表达研究

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【摘要】：背景和目的 儿童神经源性膀胱主要由于先天性神经管发育畸形后行手术治疗后神经损伤所致。另外,由于神经系统再生能力较差,在治疗方面是医学上面临的巨大难题。神经源性膀胱传统的治疗效果较差,以及不能逆转神经元损伤这一发病机理。目前脊髓损伤动物模型较多,但是均存在诸多弊端。因而,神经源性膀胱的治疗研究缺少动物模型。同时,由于神经源性膀胱的治疗研究不能仅仅依靠临床探索性治疗。因此,合适的神经源性膀胱相关动物模型较为重要。由于小儿神经源性膀胱主要由于神经管畸形行手术治疗所致,因此,我们需要寻找合理的脊髓损伤动物模型,从而得到神经源性膀胱动物模型。根据研究报道维甲酸、环磷酰胺、甲氨蝶呤、丙戊酸钠均有致小鼠、大鼠脊髓损伤的作用。但是,小鼠、大鼠均不利于神经源性膀胱的进一步治疗研究,所以,寻求一种利于神经源性膀胱治疗研究的动物模型成为当务之急。近年来干细胞移植的研究给这一医学难题带来了一定的希望。根据相关报道脊髓中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、及神经丝蛋白(NFP)及S-100蛋白的表达情况与脊髓损伤后神经源性膀胱的形成有一定的关系,我们可以通过脊髓内以上指标判断脊髓损伤情况。 我们通过探索药物性脊髓损伤与动物神经源性膀胱的关系,寻求最接近儿童发病机理的脊髓损伤动物模型,从而找出合理的神经源性膀胱动物模型制作方法。通过检测动物模型脊髓中AchE、s-100、NSE、NFP的表达情况,了解它们与脊髓损伤的关系,进而了解药物性脊髓损伤导致神经源性膀胱形成的关系。 对象和方法 我们采用SD大鼠进行预实验,选取新西兰孕兔为实验动物。 SD大鼠动物模型制作：选择刚确定怀孕的SD大鼠35只随机分为环磷酰胺组、甲氨蝶呤组、维甲酸组、丙戊酸钠组及对照组。各实验组按照配制完成的试剂于大鼠怀孕后第九天起每天16：00给予相应药物。正常对照组给予等剂量的生理盐水注射液。 新西兰孕兔动物模型制作：选择确定怀孕的新西兰兔随机分为环磷酰胺组、丙戊酸钠组、甲氨蝶呤组、维甲酸组及对照组。各实验组按照配制完成的试剂于怀孕后第五天起每天16：00给予相应药物。正常对照组给予等剂量的生理盐水注射液。 免疫组织化学观察胎兔脊髓：正常分娩后检查胎兔存活情况,检查胚胎外观,判定是否有外观可见畸形并记录结果。流产孕兔给予及时记录流产时间,收集流产胎兔,检查外观是否有可见畸形。另外,对于中途流产孕兔给予解剖,暂时给予冰冻,待标本收集完整后统一取出脊髓行HE染色及免疫组化检测。存活仔兔给予继续喂养,死亡仔兔取脊髓固定,石蜡包埋切片进一步进行免疫组织化学观察脊髓中乙酰胆碱酯酶(AchE)、S-100蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及神经丝蛋白(NFP)的水平。 数据处理 采用SPSS17.0统计软件完成数据处理。实验数据以x±s表示,进行Kolmogorov-Smirnov正态性检验,数据属正态分布的,多组间比较采用方差(ANOVA)分析和Bonferroni posthoc分析,组内比较采用t检验；数据属非正态分布的,用秩和检验(H检验)。P0.05为差异有统计学意义。 实验结果 SD大鼠动物模型：各实验组均有出现仔鼠腰骶部皮肤缺损。环磷酰胺组及甲氨蝶呤组均有孕鼠流产,流产率分别为39.13%及16.67%,流产仔鼠腰骶部外观未见皮肤缺损。实验组中,环磷酰胺和维甲酸组的致畸率相对较高,分别为13.04%及14.81%。各实验组中环磷酰胺组,甲氨蝶呤组仔鼠的死亡率较高分别为60.87%及54.17%。对照组未出现大鼠流产,所产仔鼠均未见腰骶部皮肤缺损。我们对所有大鼠解剖后均可见实验组仔鼠出现脊髓完整性较差。 新西兰孕兔动物模型：环磷酰胺、甲氨蝶呤、维甲酸组均有出现仔鼠腰骶部皮肤缺损。环磷酰胺组共产仔兔21只,死亡率76.19%,致畸率9.52%；甲氨蝶呤组共有产仔兔19只,死亡率57.89%,致畸率10.53%；丙戌酸钠组共产仔兔21只,死亡率47.62%,致畸率为0。维甲酸组共产仔兔24只,死亡率45.83%,致畸率12.5%。生理盐水对照组胎鼠全部存活,均未见明显腰骶部皮肤缺损。 免疫组化显示：胎兔脊髓中乙酰胆碱酯酶(AchE)、s-100蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、抗神经丝蛋白(NFP)的阳性区平均灰度积分光密度值(G)与生理盐水作为对照组相比较有统计学意义(P0.05)。我们发现乙酰胆碱酯酶、神经元特异性烯醇化酶的G较对照组降低.(p0.5),有统计学意义；而s-100蛋白及神经丝蛋白则升高(p0.5),有统计学意义。环磷酰胺组、丙戊酸钠组、甲氨蝶呤组及维甲酸组各组间采用方差(?)ANOVA)分析无统计学差异(P0.05)。 实验结论 1、环磷酰胺、丙戊酸钠、甲氨蝶呤及全反式维甲酸在大鼠脊髓损伤动物模型中,对大鼠脊髓有抑制作用。其中环磷酰胺、全反式维甲酸对大鼠脊髓抑制作用较丙戊酸钠及甲氨蝶呤相对较明显,但流产率较高,致畸率较低。 2、环磷酰胺、丙戊酸钠、甲氨蝶呤及全反式维甲酸对新西兰兔脊髓均有一定的程度的损伤,但是均未见外观畸形。新西兰孕兔流产率较高,仔兔死亡率相对较高,致畸率较低。其中四组中环磷酰胺、全反式维甲酸对新西兰兔较甲氨蝶呤及丙戊酸钠具有更好的脊髓损伤作用。 3、实验组新西兰仔兔脊髓内乙酰胆碱酯酶、s-100蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白与正常组相比均有一定的变化。动物模型中AchE和NSE有一定程度的降低,而s-100蛋白及神经丝蛋白有一定程度的升高,与脊髓损伤存在一定关系。
【关键词】：脊髓损伤 动物模型 神经元特异性烯醇化酶 乙酰胆碱酯酶 神经丝蛋白 S-100蛋白
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R651.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 中英文~.写词表13-14
• 前言14-16
• 第一部分 SD大鼠、兔脊髓损伤动物模型的建立探索16-26
• 1 实验材料16-18
• 2 动物预实验18-20
• 3 动物实验20-23
• 4 讨论23-26
• 第二部分 胎兔脊髓中乙酰胆碱酯酶、S-100蛋白、神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白免疫组织化学检测26-35
• 1 实验材料26-27
• 2 实验方法27-29
• 3 实验结果29-32
• 4 讨论32-35
• 结论及展望35-36
• 1 结论35
• 2 展望35-36
• 附图36-42
• 参考文献42-48
• 综述48-62
• 参考文献58-62
• 作者简历62
• 在读硕士研究生期间发表的论文62
• 基金支持62-63
• 致谢63

【参考文献】

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本文编号：705162