金黄色葡萄球菌抗原铁调节表面决定蛋白B及疫苗研究

发布时间：2017-08-20 15:15

  本文关键词：金黄色葡萄球菌抗原铁调节表面决定蛋白B及疫苗研究

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【摘要】：金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是在自然界中广泛存的一种革兰氏阳性病原菌,它具有很强的致病性。金葡菌感染不同部位会引起多种不同的疾病,如皮肤软组织感染、肺炎、乳头炎、细菌性菌血症等,感染严重者甚至可能导致死亡。金黄色葡萄球菌铁调节表面决定系统中的一个非常重要的蛋白——铁调节表面决定蛋白B (Iron responsive surface determinant B,简称IsdB)是金葡菌众多毒性致病因子之一。IsdB在金葡菌侵染宿主以及在宿主体内繁殖的过程中均起着重要作用。同时,IsdB也是一个备受关注的金葡菌疫苗研究的新型靶点。 本论文研究主要包括金黄色葡萄球菌天然IsdB蛋白、截短型IsdB(IsdB614、 IsdB639、IsdB645)蛋白的原核表达质粒的构建、表达、纯化、鉴定以及免疫原性和动物保护性实验等。通过对IsdBWT基因的大肠杆菌密码子优化,设计合成IsdBWT基因序列,构建出pET20b-IsdBWT原核表达质粒,将其作为表达质粒,并以该表达质粒为模板,通过设计截短蛋白基因序列的PCR引物,用PCR的方法获得IsdB614、IsdB639. IsdB645蛋白的核酸序列,从而构建出三种IsdB截短型蛋白的原核表达质粒。用E. coli原核表达系统表达获得大量的IsdB614、 IsdB639以及一定量的IsdBWT和IsdB645蛋白,使用亲和层析和分子筛层析结合的方法对IsdB614和IsdB639两种蛋白进行分离提纯,利用SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot等鉴定手段对几种蛋白进行特异性检测。用制备兔多抗的方法确定蛋白的免疫原性,建立小鼠腹腔内感染模型,通过蛋白免疫保护实验、血清抗体滴度检测等方法对蛋白的免疫保护效果进行了初步的评价检测。 通过本论文的实验研究,成功构建了IsdBWT、IsdB614、IsdB639、IsdB645的原核表达质粒,并对IsdB614和IsdB639两个蛋白进行了有效的分离提纯。提纯获得的IsdB639蛋白表现出很好的免疫原性,并且在小鼠的攻毒保护实验中也具有较为显著的免疫保护效果。本论文的实验研究为进一步研制有效的抑制金葡菌感染的蛋白疫苗提供依据。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 铁调节表面决定因子 原核表达 免疫保护 疫苗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 常见名词缩写10-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 金黄色葡萄球菌11-12
• 1.1.1 金黄色葡萄球菌的生物学特征11
• 1.1.2 金黄色葡萄球菌的致病性11-12
• 1.1.3 金黄色葡萄球菌的流行病学12
• 1.2 金黄色葡萄球菌铁调节表面决定系统12-14
• 1.2.1 金黄色葡萄球菌铁调节表面决定系统简介12-13
• 1.2.2 金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B简介13-14
• 1.3 金黄色葡萄球菌疫苗研究进展14-16
• 1.4 立题目的与设计思路16-18
• 1.4.1 立题目的16-17
• 1.4.2 设计思路17-18
• 第二章 材料与方法18-31
• 2.1 实验器材18-21
• 2.1.1 主要仪器18-19
• 2.1.2 实验材料19
• 2.1.3 常用试剂配制19-21
• 2.2 实验方法21-31
• 2.2.1 质粒构建、筛选21-24
• 2.2.2 表达菌筛选及蛋白的表达与纯化24-28
• 2.2.3 动物免疫攻毒实验28-31
• 第三章 实验结果31-49
• 3.1 IsdBWT蛋白原核表达质粒的构建、表达与筛选31-33
• 3.1.1 IsdBWT原核表达质粒的构建31-32
• 3.1.2 IsdBWT蛋白的表达与筛选32-33
• 3.1.3 小结33
• 3.2 IsdB截短型蛋白原核表达质粒的构建与表达菌筛选33-36
• 3.2.1 IsdB截短型蛋白原核表达质粒的构建33-35
• 3.2.2 IsdB截短型蛋白的表达菌筛选35-36
• 3.2.3 小结36
• 3.3 IsdB614和IsdB639蛋白的大量表达与纯化36-40
• 3.3.1 IsdB截短型蛋白的大量表达36-37
• 3.3.2 His Trap柱亲和层析37-38
• 3.3.3 分子筛层析38-39
• 3.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot鉴定39-40
• 3.3.5 小结40
• 3.4 IsdB614和IsdB639蛋白的免疫原性检测40-41
• 3.4.1 IsdB614和IsdB639蛋白的免疫原性检测40-41
• 3.4.2 小结41
• 3.5 IsdB639蛋白的动物保护性实验41-49
• 3.5.1 攻毒前参数的条件摸索42-43
• 3.5.2 金黄色葡萄球菌攻毒保护实验43-48
• 3.5.3 小结48-49
• 讨论49-51
• 结论51-52
• 参考文献52-58
• 附录58-65
• 作者简介65-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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中国硕士学位论文全文数据库 前4条

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本文编号：707345