肺炎链球菌热休克蛋白DnaJ相互作用蛋白的筛选及鉴定

发布时间：2017-08-21 09:00

  本文关键词：肺炎链球菌热休克蛋白DnaJ相互作用蛋白的筛选及鉴定

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【摘要】：目的肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia，S. pn）热休克蛋白DnaJ是一个毒力因子，但其对肺炎链球菌致病机制的作用尚不清楚，本文拟通过寻找DnaJ在S. pn中的相互作用蛋白来揭示其对细菌毒力的影响。 方法主要采用两种蛋白质相互作用的技术——免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）和细菌双杂交来进行相互作用蛋白的筛选与验证。质粒pAE03含有标签蛋白——绿色荧光蛋白（GreenFluorescent Protein，GFP），将DnaJ整合到该质粒上，获得重组质粒pAE03-dnaJ-gfp并转化S. pn菌株D39。收集转化细菌和野生型D39裂解液，用结合了GFP抗体的beads去捕获带GFP标签的DnaJ和它结合的相互作用蛋白，捕获蛋白质混合物采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，转化细菌与D39的差异蛋白质通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）鉴定；然后用细菌双杂交技术验证这种相互作用，并通过β-半乳糖苷酶实验和westernblot检测热休克时这种相互作用对候选蛋白的影响。同时，本文构建了诱饵质粒pBT-dnaJ和肺炎链球菌基因组文库，应用细菌双杂交技术筛选DnaJ相互作用的蛋白质并用co-IP加以证实。根据候选蛋白的生物信息学分析结果，用最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）实验研究该相互作用对细菌耐药性的影响。 结果应用co-IP技术筛选并经MALDI-TOF MS鉴定出9个可能与DnaJ有相互作用的蛋白，包括DnaK、Gap、Eno、SpxB等。细菌双杂交技术进一步证实了DnaJ与其中3个蛋白——DnaK、Eno、SpxB间的相互作用。而β-半乳糖苷酶实验和western blot证实，热休克时DnaJ可以帮助Eno和SpxB正确折叠并保护它们不受降解，还可易化Eno的胞外分泌。同时，应用细菌双杂交技术筛选到了一个DnaJ相互作用的蛋白质——SPD1264，，并通过co-IP证实两者间确实存在相互作用。通过文献查阅及初步的MIC实验，表明该蛋白可能与细菌对青霉素、氨苄青霉素及卡那霉素的耐药存在一定的联系。 结论DnaJ蛋白可以通过影响Eno和SpxB的蛋白水平及胞外分泌，从而影响细菌的毒力；此外其还可能通过影响翻译相关蛋白来影响细菌多种蛋白包括毒力因子的合成，这可能也是其影响细菌毒力的机制之一；同时DnaJ可与耐药相关蛋白SPD1264相互作用，可能通过对该蛋白的调控影响细菌的耐药。这些结果有助于我们更深入地理解DnaJ对S. pn毒力作用的机制及其与耐药间的联系。
【关键词】：肺炎链球菌 DnaJ 蛋白相互作用 免疫共沉淀 细菌双杂交
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.12;R3411
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 参考文献13-14
• 第一部分 免疫共沉淀技术筛选肺炎链球菌热休克蛋白 DnaJ 相互作用蛋白14-32
• 材料与方法14-21
• 结果21-27
• 讨论27-29
• 参考文献29-32
• 第二部分 细菌双杂交技术筛选肺炎链球菌热休克蛋白 DnaJ 相互作用蛋白及其与耐药的联系32-42
• 材料与方法32-35
• 结果35-39
• 讨论39-41
• 参考文献41-42
• 全文总结42-43
• 文献综述43-52
• 参考文献48-52
• 致谢52-53
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录53-54

【参考文献】

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1 崔瑾;张群;董杰;姜慧;周爱娥;董姗姗;张雪梅;尹一兵;王虹;;肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究[J];第三军医大学学报;2011年19期

本文编号：711959