南极磷虾胰蛋白酶表达载体构建与高效表达

发布时间：2017-08-21 10:13

  本文关键词：南极磷虾胰蛋白酶表达载体构建与高效表达

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【摘要】：南极磷虾属节肢动物门甲壳纲磷虾目，这种无脊椎动物是南极海域的关键物种，主要围绕极地分布并集中于南冰洋，为多细胞生物中生物质能最大、适应环境最成功的动物物种之一。 特殊寒冷的生活环境造就了南极磷虾体内很多活性物质都具有较高的研究价值，其中以胰蛋白酶的低温高效性较为突出。南极磷虾胰蛋白酶已经在清除机体坏死组织、治疗角膜碱烧伤以及清除牙斑等医学领域得到了广泛的应用，并且成为轻工业、食品、医药等学科的研究热点。 由于磷虾样品提取胰蛋白酶的现实困难和相对高昂的成本，本实验采用基因工程技术将南极磷虾胰蛋白酶基因转入工程菌中，利用基因工程技术表达目的蛋白并初步纯化,为南极磷虾胰蛋白酶的研究提供更加深入的资料和依据。 【研究内容】（1）以南极磷虾mRNA为模板，通过分析南极磷虾胰蛋白酶基因，设计基因特异性引 物，逆转录得到南极磷虾胰蛋白酶cDNA。（2）构建pGEX-2T-TRY（TRY代表南极磷虾胰蛋白酶）原核表达载体，转化感受态细 胞，并经PCR、双酶切及测序进行鉴定。（3）将pGEX-2T-TRY转化入工程菌E.coli BL21，优化表达条件，以实现目的蛋白的 表达。（4）工程菌经超声裂解，获得目的蛋白。检测目的蛋白的酶解活性并对目的蛋白初步 纯化。 【研究结果】（1）利用TAIL-PCR技术获得基因序列，经分析比对确认为南极磷虾胰蛋白酶基因， 设计基因特异性引物，以南极磷虾RNA为模板成功逆转录出cDNA。（2）构建的pGEX-2T-TRY原核表达载体，经PCR和双酶切以及测序鉴定证明已构建成 功。（3）工程菌E.coli BL21经IPTG诱导后，成功表达出融合蛋白，经SDS-PAGE电泳结 果分析，发现在55KDa处有明显的目的蛋白条带，与预期的结果一致。（4）选用谷胱甘肽琼脂糖凝胶来纯化带有GST标签的融合蛋白，初步纯化出目的蛋白， 但是尚未发现该蛋白具有酶活性。 【研究结论】 本实验成功构建了原核表达南极磷虾胰蛋白酶的工程菌，经IPTG诱导表达出带有GST标签的目的蛋白，经SDS-PAGE分析证明，在预期位置有明显的蛋白条带，，批量发酵菌体后，超声破菌回收蛋白，对目的蛋白进行了初步纯化和酶活性检测。
【关键词】：南极磷虾 胰蛋白酶 TAIL-PCR 克隆 载体构建 表达 纯化
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• 导师简介5
• 课题组成员5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 主要符号表13-14
• 第一部分 前言14-18
• 1.1 南极磷虾研究开发现状14-15
• 1.2 胰蛋白酶的研究现状15-16
• 1.3 南极磷虾酶的应用价值16-18
• 第二部分 南极磷虾胰蛋白酶 cDNA 的克隆与鉴定18-37
• 2.1 实验仪器与材料18-20
• 2.1.1 实验组织样本18
• 2.1.2 试剂18-19
• 2.1.3 主要仪器19-20
• 2.2 实验方法20-28
• 2.2.1 南极磷虾基因组 DNA 的获得20
• 2.2.2 南极磷虾胰蛋白酶基因片段的获得20-22
• 2.2.3 南极磷虾胰蛋白酶全基因序列的获得22-26
• 2.2.4 南极磷虾胰蛋白酶 cDNA 的获得26-28
• 2.3 实验结果28-35
• 2.3.1 提取南极磷虾胰蛋白酶基因克隆结果28-30
• 2.3.2 重组质粒 PCR 及酶切鉴定30
• 2.3.3 南极磷虾胰蛋白酶的全基因序列图及开放阅读框（ORF）结构图30-32
• 2.3.4 南极磷虾总 RNA 电泳结果32
• 2.3.5 南极磷虾胰蛋白酶 cDNA 电泳结果32-33
• 2.3.6 多物种胰蛋白酶氨基酸多序列分析33-34
• 2.3.7 系统进化树分析34-35
• 2.4 讨论35-36
• 2.5 结论36-37
• 第三部分 南极磷虾胰蛋白酶基因表达载体的构建37-45
• 3.1 实验材料和试剂37-38
• 3.1.1 菌株与载体37
• 3.1.2 LB 固体和液体培养基37
• 3.1.3 实验试剂37
• 3.1.4 主要仪器37-38
• 3.2 实验方法38-40
• 3.2.1 质粒 pGEX-2T 的验证38
• 3.2.2 双酶切南极磷虾胰蛋白酶 cDNA38-39
• 3.2.3 双酶切质粒 pGEX-2T39
• 3.2.4 连接并转化 E.coli BL21 感受态细胞39-40
• 3.2.5 筛选并验证40
• 3.3 实验结果40-43
• 3.3.1 质粒完整性验证结果40-41
• 3.3.2 双酶切 pGEX-2T 及南极磷虾胰蛋白酶 cDNA41-43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 结论44-45
• 第四部分 融合蛋白的表达、鉴定与纯化45-55
• 4.1 实验材料45-47
• 4.1.1 菌株45
• 4.1.2 试剂45-47
• 4.1.3 主要仪器47
• 4.2 实验方法47-51
• 4.2.1 表达47-49
• 4.2.2 优化表达条件49
• 4.2.3 纯化49-50
• 4.2.4 测定酶活性50-51
• 4.3 实验结果51-54
• 4.3.1 初步表达的 SDS-PAGE 分析51-52
• 4.3.2 优化条件表达的 SDS-PAGE 分析52-53
• 4.3.3 Glutathione Sepharose 4B 纯化后的 SDS-PAGE 分析53
• 4.3.4 蛋白纯化前后的蛋白浓度测定53-54
• 4.3.5 酶活力测定结果54
• 4.4 讨论54
• 4.5 结论54-55
• 参考文献55-58
• 综述58-65
• 参考文献63-65
• 攻读学位期间已（待）发表的文章65-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：712284