大鼠miR-21慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

发布时间：2017-08-21 22:38

  本文关键词：大鼠miR-21慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

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【摘要】：目的采用分子生物学方法构建miR-21慢病毒载体,并感染骨髓间充质干细胞(MSCs),建立稳定表达miR-21的MSCs细胞系。方法合成大鼠miR-21基因序列,进行PCR扩增后,连接到慢病毒表达质粒p LVX-shRNA2中。对其进行双酶切及基因测序鉴定,证实载体p LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p的成功构建。对载体进行包装、测定病毒滴度。分4组:MSCs组不转染病毒液,空载组转染空载病毒液,miR-21组1用miR-21慢病毒载体以MOI 20转染MSCs,miR-21组2用miR-21慢病毒载体以MOI 40转染MSCs。将慢病毒颗粒以不同感染复数(MOI)感染MSCs,检测感染效率,使用实时定量PCR法检测MSCs中miR-21的表达。结果目的基因与慢病毒载体成功连接。病毒滴度约为6×10~8CFU/m L。载体成功感染MSCs,转染效率达90%以上。实时定量PCR检测结果证实miR-21组1(MOI为20)、miR-21组2(MOI为40)miR-21表达量分别为4.05±0.07、4.06±0.04,与MSCs组(1.07±0.05)及空载组(1.12±0.05)相比差异有统计学意义(F=3 014.962,P=0.000)。结论采用分子生物学方法成功构建了大鼠miR-21慢病毒载体系统p LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p,并成功转染MSCs,得到稳定表达miR-21的MSCs细胞系,从而为进一步研究miR-21的生物学特性提供实验基础。
【作者单位】： 南方医科大学珠江医院妇产科;
【关键词】： miR- 慢病毒 骨髓间充质干细胞 大鼠
【基金】：国家自然科学基金资助项目(编号:81300462) 广东省科技计划项目(编号:2012B031800123) 广东高校优秀青年创新人才培养计划项目育苗工程(编号:2012LYM_0034)
【分类号】：R373
【正文快照】： 微小RNAs(miRNAs)是存在于真核生物中的由18~25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA,其功能是参与基因转录后水平的调控,通过与靶mRNA的碱基配对,导致靶mRNA的降解或翻译抑制,从而进行基因表达的调控[1]。研究证实miRNAs参与细胞的增殖与凋亡、器官发育、分化等重要生物学事

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