预测的鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白的定位、免疫原性及表达特性初步研究

发布时间：2017-08-23 00:32

  本文关键词：预测的鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白的定位、免疫原性及表达特性初步研究

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【摘要】：目的 预测鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲsecretion system,T3SS)效应蛋白编码基因,研究预测蛋白在感染细胞中的定位、免疫原性及其在感染细胞中的表达时相,为进一步研究其结构与功能奠定基础。 方法 用计算机辅助的生物信息学方法Effective T3.BPBAac tool,以及根据其他文献资料,预测Cps T3SS效应蛋白编码基因。提取Cps6BC菌株DNA为模板,设计特异性引物,PCR扩增预测Cps T3SS效应蛋白编码基因,酶切后连接到载体pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-6P-1/目的片段,经PCR、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导表达。Western blot分析和鉴定表达产物；对温度、IPTG浓度和时间等诱导表达条件进行系列的优化后,获得可溶性表达蛋白并大量诱导表达。GST树脂纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度；将重组蛋白经皮下注入免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中重组蛋白多克隆抗体的效价,以评价这些蛋白的免疫原性；并以制备的多克隆抗体为抗,应用间接免疫荧光检测预测蛋白在感染细胞中的定位。在Cps感染后2、8、24、48h后,用Western blot检测这些蛋白的表达情况。 结果 应用生物信息学软件预测了5个可能的Cps T3SS效应蛋白编码基因：CPSIT0930.CPSIT0767.CPSIT0749.CPSIT0580.CPSIT0420.PCR扩增得到其目的片段；构建的重组质粒经PCR和测序证实插入片段为目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致；SDS-PAGE结果显示,在IPTG诱导下,对诱导表达条件进行系列的优化后,分别表达了相对分子量(Mr)与预测分子量相近的可溶性蛋白。重组蛋白经GST树脂纯化后,免疫雌性BALB/c小鼠,收集血清,抗CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749抗体效价为1：16000,抗CPSIT_0580、CPSIT0420效价为1：8000。IFA进行细胞内定位发现CPSIT_0930、 CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT_0420均定位于包涵体内。除CPSIT_0767在Cps感染后48h才开始表达外,其余蛋白均在感染后2h开始表达,8h后表达停止。 结论 1.CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT0420蛋白具有较好的免疫原性； 2. CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT0420蛋白在Cps感染细胞中定位于包涵体内； 3. CPSIT0930、CPSIT0749、CPSIT0580、CPSIT0420蛋白在Cps感染早期表达。
【关键词】：鹦鹉热嗜衣原体 Ⅲ型分泌系统 效应蛋白 定位 时相表达
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R374.2;R392
【目录】：

• 目录3-4
• 主要缩略语英文索引4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 实验材料11-13
• 实验方法13-23
• 实验结果23-29
• 讨论29-31
• 结论31-32
• 参考文献32-37
• 文献综述37-46
• 参考文献43-46
• 发表论文46-47
• 致谢47

【共引文献】

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本文编号：721975