不同温度下福氏志贺菌磷酸化蛋白质组的比较差异研究

发布时间：2017-08-23 19:37

  本文关键词：不同温度下福氏志贺菌磷酸化蛋白质组的比较差异研究

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【摘要】：志贺菌是细菌性痢疾的主要病原菌之一,其侵袭力受外界环境影响很大,如30℃时无侵袭力。目前将磷酸化修饰变化-蛋白表达量变化-温度改变三者综合研究的报道较少。本论文运用多维蛋白质染色的方法针对30℃、37℃下培养的福氏志贺菌同时展开全蛋白质组和磷酸化蛋白质组的差异研究。 本实验在平行制备全蛋白样品后,以二维凝胶电泳进行分离。接着运用蛋白质多维染色方法展示其差异,结合高精度质谱鉴定,初步探讨福氏志贺菌在不同温度下磷酸化蛋白质组及全蛋白质组的修饰及表达变化。 本实验鉴定了55种有磷酸化修饰变化或表达改变的磷酸化蛋白,它们的功能主要集中于翻译系统(24.6%)、碳源运输和代谢(21.1%)以及翻译后修饰(10.5%)。按照磷酸化修饰随温度变化分类,有18种蛋白在30℃时磷酸化程度强于37℃,6种蛋白只在30℃有磷酸化修饰,21种蛋白只在37℃有磷酸化修饰,10种蛋白在37℃时磷酸化程度强于30℃。 其中,翻译延伸因子EF-Tu在30℃时磷酸化修饰显著强于37℃,有研究证明EF-Tu的磷酸化修饰可抑制其功能。核苷二磷酸激酶NDPK在30℃时磷酸化修饰强于37℃,减慢了嘌呤嘧啶合成,从而减缓细菌30℃时的生长速度。谷氨酸脱羧酶GAD只在30℃有磷酸化修饰,同时30℃时蛋白表达明显下调,两者的共同调控减弱了它的功能。6-磷酸果糖激酶PfkB只在37℃有磷酸化,它是糖酵解途径的关键调节中心,其磷酸化修饰有激活糖酵解途径的功能。37℃时双组分信号转导系统中膜孔蛋白OmpC表达量高于30℃,同时37℃时磷酸化修饰也强于30℃,暗示它在37℃时受到表达量与磷酸化修饰的协同作用而增强。PTS系统中Crr在37℃时磷酸化程度强于30℃,在37℃表达量也上升,它们的协同作用可能增强了Crr的功能。 志贺菌的毒力主要是通过Ⅲ型分泌系统以及毒力岛表现的,在入侵宿主之后需要对机体环境做出一系列适应性改变才能高效发挥其毒力作用。例如,上文中提到的GAD和OmpC在37℃时在表达水平和磷酸化修饰水平受到同向调控功能得到增强,以适应机体环境(温度、pH值、渗透压)从而确保毒力的发挥。实验中鉴定到的PhoP只在37℃时有磷酸化修饰,这一修饰可能是针对镁离子发生的调控,增强了细菌的侵袭力。另外,鉴定到的EF-Tu、DnaK,嘌呤核苷磷酸化酶可能是Ⅲ型分泌系统的效应蛋白。 细菌蛋白的表达和翻译后修饰是动态过程,本论文运用多维染色方法系统研究了不同温度下志贺菌磷酸化蛋白质组和全蛋白质组的修饰变化及表达差异,为后续的功能研究提供了参考。
【关键词】：福氏志贺菌 磷酸化 多维蛋白质组
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 论文摘要4-5
• Abstract5-6
• 前言6-10
• 志贺菌毒力表现与温度相关性6
• 志贺菌毒力基因受温度调控的机制6-7
• 志贺菌毒力的蛋白质组学研究7-9
• 多维蛋白质组学方法简介9
• 研究目的及意义9-10
• 材料与方法10-20
• 材料10
• 实验流程10-11
• 全蛋白样品的准备11-12
• 多维蛋白质组二维凝胶电泳12-18
• LC-MS-MS液质联用质谱鉴定18-19
• 质谱数据处理与分析19-20
• 结果与讨论20-58
• 1. 样品准备阶段的定量结果20-22
• 2. 二维凝胶电泳染色结果22-26
• 3. 蛋白斑点分析26-27
• 4. 鉴定蛋白结果的整体分析27-31
• 5. 不同温度与磷酸化蛋白的变化31-34
• 6. 物质能量代谢中的磷酸化蛋白34-42
• 7. 细菌特有的蛋白磷酸化系统42-48
• 8. 蛋白质转录与翻译系统中的磷酸化蛋白48-51
• 9. 应激反应中的磷酸化蛋白51-54
• 10. 毒力调控与磷酸化蛋白54-56
• 11. 不足与展望56-58
• 总结58-59
• 参考文献59-66
• 附录66-99
• 附表一：鉴定蛋白的凝胶染色比较66-81
• 附表二：蛋白斑点数据及鉴定结果81-96
• 附表三：磷酸化肽段信息96-97
• 附表四：磷酸化肽段质谱图97-99
• 致谢99-100

【参考文献】

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1 王振雄,周培瑾;冷激蛋白CspA家族[J];生物工程学报;1999年02期

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本文编号：726906