发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）感染中宿主相关miRNA表达谱研究

发布时间：2017-08-25 00:02

  本文关键词：发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）感染中宿主相关miRNA表达谱研究

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【摘要】：目的 发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是近年来我国新发现布尼亚病毒科白蛉病毒属的病毒,迫切需要阐明SFTSV的感染机制和致病机理,这对于制定有效的预防和治疗措施具有重要意义,但目前在这方面的研究尚缺乏。本研究从发热伴血小板减少综合征病人的血清样本中获得miRNA的表达谱,并建立THP-1细胞感染模型初步探寻表达差异的miRNA与SFTS病毒感染的关联性,有助深入理解及研究SFTS病毒感染的致病机理、疾病进程以及免疫功能等,可为临床防制、新型抗病毒治疗方式的开发提供参考。方法1)鉴定感染患者血清microRNAs的差异表达,通过TaqMan低密度芯片(TLDA)获得血清miRNA的表达谱,用定量RT-PCR(qRT-PCR)进行验证,分析和鉴定病毒感染和宿主免疫应答的相关miRNAs。 2)建立THP-1细胞SFTSV体外感染模型,分析表达显著改变的miRNAs以及mRNAs表达水平,并结合生物信息学,预测差异表达miRNA的功能,试图从病毒蛋白作用、宿主与病毒相互作用、宿主自身状态等角度探究病毒感染发病机制。应用实时荧光定量PCR的方法进行miRNA表达的验证,以进一步确认与病毒感染相关的microRNA。结果1)分析血清TLDA芯片结果,发现与正常人血清相比,SFTS血清表达上调超过2倍的miRNA有117个,表达下调超过2倍的miRNA有30个。其中,变化倍数在2-4之间的有22个,变化倍数在4-10之间的有25个,10-40倍之间的有27个,40-200倍之间的有14个,超过300倍的有32个。对表达差异较为明显的miRNA进行分析,发现22个与病毒感染或免疫功能相关的miRNA,其中上调的有20个,下调的有2个。使用qRT-PCR技术验证了我们在TLDA芯片表达谱差异表达miRNA中选出的22种候选miRNA的表达量。经过定量RT-PCR验证,显示显著变化的9种表达差异miRNA (miR-146a、miR-15b、miR-24、miR-628-5p、 miR-101、miR-126、miR-155. miR-221、miR-34a)。2)借助于AffymetrixmiRNA芯片,以THP-1细胞作为SFTSV体外感染模型,分析表达显著改变的miRNA以及mRNA表达水平,在最终548个靶基因中发现16个差异表达miRNA具有调控的靶基因,上调miRNA13个,hsa-miR-149,, hsa-miR-155, hsa-miR-1915, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-221, hsa-miR-193b, hsa-miR-146a, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-132, hsa-miR-1908, hsa-miR-638, hsa-miR-1469:下调miRNA3个,hsa-miR-1307, hsa-miR-345, hsa-miR-320a。靶标TOLL信号通路中重要调控因子(如TNF、CAT、IL1B、STAT1、 CCL5、MAP3K11、CD81、LITAF、CARD9)及对抗药物反应因子SLC1A3、CENPF。并且在THP-1细胞水平中采用qRT-PCR验证了miR-146a、miR-155的差异表达。采用MAS3.0软件对上/下调miRNA调控的靶基因分别进行GO/KEGG功能注释分析。上调与下调miRNA调控的靶基因KEGG功能注释分析发现,这些基因参与调控的信号途径有抗原加工、宿主对抗、细胞因子相互作用、信号传导等。结果提示差异表达的miRNA可能与SFTSV感染相关的主要信号通路的重要基因相关。结论本研究从血清与细胞水平,分析与SFTSV感染相关差异表达miRNA,首次从miRNA角度初步探寻SFTS病毒感染的分子致病和免疫机理,并为研发有效疾病防控与治疗措施提供参考。
【关键词】：发热伴血小板减少综合征病毒 血清 microRNAs 低密度芯片 细胞miRNA和mRNA表达谱 靶基因 免疫应答
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSRTACT6-12
• 缩略词表12-13
• 第一章 研究背景综述13-31
• 1.1 发热伴血小板减少综合征病毒研究进展13-19
• 1.1.1 疾病的发现13-14
• 1.1.2 SFTS的临床表现与诊断14-15
• 1.1.3 SFTS的传播途径15
• 1.1.4 SFTSV的致病机理研究进展15-19
• 1.2 miRNA相关研究进展19-24
• 1.2.1 miRNA概述19-20
• 1.2.2 miRNA的结构与加工成熟过程20-21
• 1.2.3 miRNA作用机制21-24
• 1.3 生物信息学与miRNA功能研究24-25
• 1.4 研究目的25-26
• 参考文献26-31
• 第二章 发热伴血小板综合征患者血清miRNA表达谱研究31-53
• 2.1 研究技术路线32
• 2.2 SFTSV血清miRNA表达谱鉴定32-37
• 2.2.1 实验材料32-34
• 2.2.2 实验方法34-37
• 2.3 SFTSV血清miRNA表达谱qRT-PCR验证37-40
• 2.3.1 研究对象37
• 2.3.2 实验材料37-38
• 2.3.3 实验方法38-40
• 2.4 实验结果40-48
• 2.4.1 TLDA芯片miRNA表达谱分析40
• 2.4.2 病毒感染和宿主免疫相关miRNA分析40-46
• 2.4.4 差异表达qRT-PCR验证46-48
• 2.5 讨论48-49
• 参考文献49-53
• 第三章 发热伴血小板综合征病毒感染细胞水平miRNA筛选及预测功能分析53-85
• 3.1 SFTSV感染细胞54-58
• 3.1.1 实验材料54-55
• 3.1.2 实验方法55-58
• 3.2 SFTSV感染THP-1细胞miRNA表达谱鉴定58-64
• 3.2.1 实验材料58-59
• 3.2.2 实验方法59-64
• 3.3 miRNA表达谱检测64-66
• 3.3.1 实验材料64
• 3.3.2 实验方法64-66
• 3.4 SFTSV感染THP-1细胞miRNA qRT-PCR验证66
• 3.5 实验结果66-80
• 3.5.1 ELISA法检测不同稀释度病毒感染后NP蛋白表达结果66-67
• 3.5.2 间接免疫荧光法检测NP蛋白表达情况67-68
• 3.5.3 S基因拷贝数68-69
• 3.5.4 RNA质量检测结果69-70
• 3.5.5 miRNA芯片检测结果70
• 3.5.6 mRNA芯片检测结果70-71
• 3.5.7 miRNA筛选及预测功能分析71-76
• 3.5.8 miRNA介导的靶标蛋白相互作用网络构建76-79
• 3.5.9 SFTSV感染THP-1细胞miRNA qRT-PCR验证79-80
• 3.6 讨论80-82
• 参考文献82-85
• (附) 第四章 欧洲类禽猪流感病毒分离及生物信息学分析85-105
• 4.1 材料与方法86-90
• 4.1.1 病毒分离与鉴定86-87
• 4.1.2 病毒RNA提取和RT-PCR87-88
• 4.1.3 RT-PCR产物克隆88-89
• 4.1.4 全基因组完整编码序列测定及分析89-90
• 4.2 实验结果90-102
• 4.2.1 病毒分离鉴定90-91
• 4.2.2 病毒基因序列测定91
• 4.2.3 同源性比较91-93
• 4.2.4 系统进化分析93-94
• 4.2.5 核苷酸及氨基酸分析94-102
• 4.3 讨论102-103
• 参考文献103-105
• 在读期间学术成果105-106
• 致谢106-107

【共引文献】

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本文编号：733868