维生素D3抑制LPS诱导氧化应激的作用机制研究

发布时间：2017-08-25 06:37

  本文关键词：维生素D3抑制LPS诱导氧化应激的作用机制研究

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【摘要】：目的：维生素D3参与免疫系统调节，与机体固有免疫有关，维生素D3具有抗氧化作用，但其在氧化应激中的作用机制尚不明确。本实验通过LPS诱导氧化应激与DNA损伤，并观察维生素D3对LPS诱导的氧化应激与DNA损伤的保护作用，并就其机制进行研究。方法：选用人B淋巴母细胞株，分为PBS对照组、 LPS组、LPS＋维生素D3组。采用ROS探针，用酶标仪和激光共聚焦显微镜检测细胞内ROS水平；采用单细胞电泳彗星实验（COMET SOP），用激光共聚焦显微镜检测DNA损伤；采用流式细胞仪检测和共聚焦免疫荧光显微镜，用Annexin v-FITC方法检测细胞凋亡；使用Edu增殖试剂盒和CCK8增殖试剂盒，检测细胞增殖。用免疫荧光结合Edu增殖检测方法观察增值细胞中NF-kB磷酸化和NF-kB表达；6、用免疫印迹方法检测NFkB磷酸化、NF-kB和TNF-α表达。结果：1、全波长分光光度仪（酶标仪）结果显示， LPS组ROS的OD值（0.1914±0.149）明显高于PBS对照组（0.0375±0.0021）（P＜0.05）,显示LPS能够诱导细胞ROS产生；LPS＋维生素D3组其ROS的OD值（0.1031±0.0058）明显低于LPS组（0.1914±0.149）（P＜0.05）,显示LPS＋维生素D3组能够明显的抑制LPS诱导细胞产生氧化应激；同时使用共聚焦荧光显微镜结果显示：LPS刺激组荧光强度值（64.82±4.43）明显高于PBS对照组（13.45±0.91）（P＜0.05）,显示LPS能够诱导细胞ROS产生；LPS＋维生素D3组其荧光强度值为：（48.24±1.46）明显低于LPS刺激组组（64.82±4.43）（P＜0.05）,显示LPS＋维生素D3刺激组能够明显的抑制LPS诱导细胞产生氧化应激；2、单细胞电泳（彗星实验）检测受损细胞尾长，LPS刺激组细胞尾长值（943.41±96）明显高于对PBS对照组（98.52±43）（P＜0.01）,显示LPS能够诱导细胞DNA损伤；LPS＋维生素D3刺激组细胞尾长值（286.43±52）明显低于LPS刺激组（943.41±96）（P＜0.01）；显示LPS＋维生素D3刺激组能够明显的抑制LPS诱导细胞DNA损伤；3、共聚焦荧光显微观察细胞凋亡显示：1ug/ml LPS刺激组细胞凋亡值（13±1.41421）与PBS对照组（9±1.41421）（P＞0.05）无统计学意义；10ug/ml LPS刺激组细胞凋亡值（22.5±3.53553）与1ug/ml LPS刺激组（13±1.41421）（P＞0.05）无统计学意义；PBS对照组细胞凋亡值（9±1.41421）与10ug/ml LPS刺激组凋亡值（22.5±3.53553）（P＞0.05）无统计学意义；流式细胞仪检测细胞凋亡值显示：1ug/mlLPS刺激组细胞凋亡值（30.3±6.237）与PBS对照组细胞凋亡值（20.3±2.45）（P＞0.05）无统计学意义；10ug/ml LPS刺激组细胞凋亡值（23.3±3.151）与1ug/ml LPS刺激组细胞凋亡值（30.3±6.237）（P＞0.05）无统计学意义；PBS对照组细胞凋亡值（20.3±2.45）与10ug/ml LPS刺激组细胞凋亡值（23.3±3.151）（P＞0.05）无统计学意义；4、共聚焦荧光显微镜观察（Edu染色法）细胞增殖显示：LPS刺激组细胞增殖比（79.51±10.60）明显高于PBS对照组细胞增殖比（9.34±1.41）（P＜0.05）显示LPS能够促进细胞增殖；LPS＋维生素D3刺激组细胞增殖比（48.68±6.34）明显低于LPS刺激组细胞增殖比（79.51±10.60）（P＜0.05）显示维生素D3能够明显抑制LPS诱导细胞增殖；同时使用全波长分光光度仪（酶标仪）检测细胞OD值，LPS刺激组细胞细胞OD值为：（6.28±4.43）明显高于对PBS对照组（0.75±0.13）（P＜0.05）显示LPS能够促进细胞增殖；LPS＋维生素D3刺激组细胞OD值为：（4.08±0.93）明显低于LPS组（6.28±0.43）（P＜0.05）显示LPS＋维生素D3刺激组能够明显抑制LPS诱导细胞增殖；LPS＋维生素D3刺激组细胞OD值为：（4.08±0.93）高于PBS对照组（0.75±0.13）（P＜0.05）显示LPS＋维生素D3刺激组存在细胞增殖。5、共聚焦荧光显微镜观察增殖细胞在NF-kB磷酸化表达：LPS刺激组增殖细胞比为：（80.63±7.92）明显高于对PBS对照组（9.72±1.34）（P＜0.05）显示LPS能够促进细胞增殖；LPS＋维生素D3刺激组细胞增殖比为：（40.32±4.32）明显低于LPS刺激组（80.63±7.92）（P＜0.05）显示LPS＋维生素D3刺激组能够明显抑制LPS诱导细胞增殖；LPS＋维生素D3刺激组细胞增殖比为：（40.32±4.32）高于PBS对照组（9.72±1.34）（P＜0.05）显示LPS＋维生素D3刺激组存在细胞增殖。共聚焦荧光显微镜观在察NF-kB细胞增殖比：LPS刺激组细胞增殖比为：（70.49±7.64、39）明显高于PBS对照组（11.12±1.27）（P＜0.05）显示LPS能够促进细胞增殖；LPS＋维生素D3刺激组细胞增殖比为：（39.11±3.72）明显低于LPS刺激组（70.49±7.64、39）（P＜0.05）显示LPS＋维生素D3刺激组能够明显抑制LPS诱导细胞增殖；LPS＋维生素D3刺激组细胞增殖比为：（39.11±3.72）高于PBS对照组（11.12±1.27）（P＜0.05）显示LPS＋维生素D3刺激组存在细胞增殖。6、用免疫印迹方法检测NF-kB，NF-kB磷酸化和TNF-a表达,结果显示：LPS能明显诱导NFkB表达，NF-kB磷酸化和TNF-a表达，其光密度与Actin比较，LPS刺激组NF-kB磷酸化（1.928±0.031）较PBS对照组（0.732±0.018）表达水平增高（P＜0.05）,表明LPS能诱导NF-kB磷酸化表达；LPS＋维生素D3刺激组NF-kB磷酸化(0.972±0.024）较LPS刺激组（1.928±0.031）表达水平减低（P＜0.05）,表明维生素D3能抑制LPS诱导NF-kB磷酸化表达。LPS组NF-kB光密度（1.546±0.058）较PBS对照组（0.841±0.014）表达水平增高（P＜0.05），表明LPS能诱导NFkB表达；LPS＋维生素D3刺激组NF-kB光密度（0.993±0.032）较LPS刺激组（1.546±0.058）表达水平减低（P＜0.05），表明维生素D3能抑制LPS能诱导NF-kB表达；LPS刺激组TNF-α光密度（1.176±0.041）较PBS对照组（0.891±0.027）表达水平增高（P＜0.05），表明LPS能诱导TNF-α表达；LPS＋维生素D3刺激组TNF-α光密度（1.004±0.039）较LPS刺激组（1.176±0.041）表达水平减低（P＜0.05），表明维生素D3能抑制LPS诱导的TNF-a表达。结论：1.LPS能够诱导人B淋巴母细胞发生氧化应激，，维生素D3能有效的抑制LPS诱导人B淋巴母细胞的氧化应激。2.LPS能够诱导人B淋巴母细胞的DNA损伤，维生素D3能有效的抑制LPS诱导人B淋巴母细胞的DNA损伤。3.LPS不能诱导人B淋巴母细胞的凋亡，但能诱导细胞增殖，维生素D3能有效的抑制LPS诱导人B淋巴母细胞的细胞增殖。4.维生素D3能有效抑制在细胞因子NF-kB磷酸化，NF-kB表达和TNF-a表达。
【关键词】：维生素D3 氧化应激 脂多糖 增殖 DNA损伤
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 前言13-17
• 材料和方法17-30
• 结果30-47
• 讨论47-51
• 结论51-52
• 参考文献52-57
• 英汉缩略词对照表57-58
• 致谢58-59
• 综述59-67
• 参考文献64-67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 巴罗;刘亚峰;;IL-17及其相关因子在呼吸道炎症疾病中的研究进展[J];华西医学;2008年02期

2 刘清敏,刘景艳;炎症细胞与COPD发病机制的关系[J];中原医刊;2004年19期

本文编号：735629