骨髓间充质干细胞内源性白细胞介素-6的分泌机制研究

发布时间：2017-08-26 02:27

  本文关键词：骨髓间充质干细胞内源性白细胞介素-6的分泌机制研究

  更多相关文章： Toll样受体2 PGN-SA Ad-siTLR2 PDTC 白细胞介素-6 NFκB Ad-IL-6 siIL-6 MSC 白细胞介素-6 抗凋亡 静息膜电位

【摘要】：第一部分骨髓间充质干细胞Toll样受体2信号通路对IL-6分泌的影响 目的利用特异性的激动剂、阻断剂以及siRNA，探讨MSC中TLR2、NFκB对IL-6分泌的影响，揭示MSC内源性IL-6分泌的可能信号通路，并通过MSC与OGD损伤PC12细胞体外共培养模型，初步探讨MSC内源性分泌IL-6的可能生物学功能。 方法在本课题组前期研究工作基础上，以EBSS无糖培养基替换PC12常规培养基，在5%O2、95%N2和5%CO2的三气培养箱中37℃培养4h，建立OGD损伤PC12细胞模型，损伤后与MSC混合共培养24h，同时以单独OGD损伤PC12为损伤对照组，以正常PC12细胞共培养为共培养对照组，western blotting方法检测凋亡因子Bax的表达变化，ELISA试剂盒检测不同处理组中IL-6的分泌水平变化。TLR2激动剂PGN-SA8ug/ml处理MSC24h、腺病毒Ad-siTLR2干预MSC24h和48h，或NFκB阻断剂PDTC处理MSC24h后，分别用real-time PCR和/或western blotting检测不同干预条件下MSC中TLR2、NFκB和IL-6的mRNA和蛋白表达水平。 结果（1）经western blotting检测，OGD损伤的PC12细胞与MSC混合共培养组中凋亡因子Bax的表达水平显著低于PC12OGD损伤组及PC12细胞自身共培养组（P0.05，P0.01）。（2）ELISA方法检测显示OGD损伤的PC12细胞与MSC混合共培养组中IL-6的分泌水平显著高于PC12OGD损伤组及PC12细胞自身共培养组（P0.001）。（3）real-time PCR结果发现，PGN-SA及Ad-siTLR2均可特异性激动或抑制TLR2的mRNA表达水平（P0.01，P0.001），与未处理组比较具有统计学差异（P0.05，P0.01，P0.001）；同时随着TLR2mRNA表达水平的变化，细胞中的NFκB和IL-6mRNA表达水平也会呈现相应的增高或降低。（4）western blotting检测结果显示，PGN-SA可特异性上调MSC中TLR2的蛋白表达水平（P0.01），并引起NFκB和IL-6的蛋白表达水平增高，经灰度值统计学分析，与未处理组相比均具有统计学差异（P0.01）； Ad-siTLR2特异性抑制MSC中TLR2的蛋白表达水平（P0.01），同时导致NFκB和IL-6的蛋白表达水平降低，经灰度值统计学分析，与RFP组比较均具有统计学差异（P0.01，P0.001）；NFκB的阻断剂在特异性下调MSC中NFκB蛋白表达水平的同时（P0.01），继而导致IL-6的蛋白表达水平显著降低（P0.05），但对TLR2的表达无明显影响（P0.05）。 结论（1）MSC共培养可降低OGD损伤PC12细胞中凋亡基因Bax的表达水平，提示MSC对损伤的PC12细胞具有修复作用，这种修复作用可能与MSC内源性IL-6的高分泌有关。（2）PGN-SA或Ad-siTLR2可特异性改变TLR2的表达水平，，同样也可引起NFκB和IL-6表达水平的相应变化。（3）PDTC可有效抑制MSC中NFκB和IL-6的表达水平，但对TLR2的表达无显著作用，提示MSC分泌IL-6是通过TLR2/NFκB信号通路而实现的。 第二部分白细胞介素-6对Toll样受体2信号通路及其神经修复的影响 目的筛选siIL-6-MSC稳定细胞株，并用腺病毒Ad-IL-6干预MSC探讨MSC内源性IL-6分泌对TLR2/NFκB信号通路的调控，阐明MSC分泌IL-6的分子机制，并揭示MSC对损伤PC12细胞可能的修复功能。 方法腺病毒Ad-IL-6瞬时干预MSC24h或48h后,利用real-timePCR或western blotting检测干预后MSC中TLR2、NFκB和IL-6的mRNA及蛋白表达水平变化。采用siIL-6慢病毒感染MSC，通过5ug/ml的puromycin进行加压筛选，获得siIL-6稳定表达的MSC细胞株并鉴定。将所获得的siIL-6-MSC细胞与OGD损伤PC12细胞共培养24h,同时以GFP-MSC为共培养对照组，western blotting检测凋亡基因Bax的表达变化，全细胞膜片钳检测共培养组中PC12细胞的静息膜电位变化情况。 结果（1）腺病毒Ad-IL-6感染MSC后可明显上调IL-6的mRNA和蛋白表达水平（P0.01，P0.001），但并不影响TLR2和NFκB的表达。（2）经puromycin筛选后获得的siIL-6-MSC稳定细胞株，在倒置荧光显微镜下可见较强绿色荧光，感染率约85%以上，进一步检测siIL-6-MSC稳定细胞株中IL-6的mRNA和蛋白表达水平均有显著性的降低（P0.05，P0.001），但该细胞中的TLR2和NFκB的表达水平并没有显著性的变化。（3）OGD损伤PC12细胞与siIL-6-MSC共培养后，其凋亡因子Bax的表达水平明显高于GFP-MSC对照组（P0.01）；全细胞膜片钳检测与siIL-6-MSC共培养后的OGD损伤PC12细胞膜静息电位与阈电位差值明显高于对照组。表明IL-6表达水平降低时，MSC对OGD损伤PC12细胞的促修复作用下降。 结论（1）成功筛选出siIL-6稳定表达的MSC细胞株。（2）IL-6表达水平的增高或降低并不影响MSC中TLR2和NFκB的表达变化，进一步验证MSC内源性IL-6的分泌是通过TLR2/NFκB信号通路而实现的，且IL-6的分泌对MSC中TLR2/NFκB信号通路没有反馈性调节作用。（3）IL-6表达下降时，MSC对损伤PC12细胞的促修复作用降低，提示MSC内源性的IL-6可能在促进损伤神经细胞的抗凋亡和神经活性恢复中发挥生物学功能。
【关键词】：Toll样受体2 PGN-SA Ad-siTLR2 PDTC 白细胞介素-6 NFκB Ad-IL-6 siIL-6 MSC 白细胞介素-6 抗凋亡 静息膜电位
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-16
• 前言16-19
• 第一部分 骨髓间充质干细胞中Toll样受体2信号通路对白细胞介素-6分泌的影响19-39
• 1 材料与方法19-29
• 2 结果29-36
• 3 讨论36-38
• 小结38-39
• 第二部分 白细胞介素-6 对 Toll 样受体 2 信号通路及其神经修复的影响39-52
• 1 材料与方法39-42
• 2 结果42-49
• 3 讨论49-51
• 小结51-52
• 全文总结52-53
• 文献综述53-66
• 全文参考文献58-66
• 致谢66-67
• 攻读硕士学位期间的研究成果及发表的学术论文目录67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘晶晶;张峗;毕杨;龚敏;李廷玉;陈洁;;大鼠白细胞介素-6重组腺病毒构建及初步鉴定[J];免疫学杂志;2014年02期

本文编号：739130