不同佐剂下幽门螺杆菌UreB疫苗的Th表位优势应答研究

发布时间：2017-08-27 05:26

  本文关键词：不同佐剂下幽门螺杆菌UreB疫苗的Th表位优势应答研究

  更多相关文章： 幽门螺杆菌 尿素酶B亚单位 Th表位 免疫佐剂

【摘要】：背景： 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， Hp）是定植于人胃粘膜及十二指肠粘膜局部的革兰阴性杆菌。全球范围感染率超过50%，与慢性胃炎，消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤密切相关，已被世界卫生组织列为人类的一类致病因子。目前临床上主要通过联用多种抗生素与质子泵抑制剂对Hp感染患者进行治疗。但由此产生的抗生素耐药问题越来越突出，同时还存在患者依从性差及再次感染率高等问题，因此研发新的抗菌疫苗以预防或清除局部Hp已十分必要。 目前针对Hp所设计的全菌疫苗，可诱导机体产生有效的保护性应答，但因其抗原成分复杂常导致较多的副反应发生。而通过重组表达某一抗原成分设计的亚单位疫苗不仅可诱导机体产生特异性免疫应答反应，而且安全性更高。然而在疫苗研发过程中发现，同一蛋白抗原分别采用不同佐剂或同一佐剂的不同免疫途径进行疫苗接种后，往往出现截然不同的免疫保护效果。Hp为一种胞外感染菌，可诱导机体产生强烈的CD4+T细胞应答，已经证实特异性CD4+T细胞免疫应答在机体抗Hp感染过程中发挥重要的免疫保护作用。而抗原所激发的特异性CD4+T细胞应答主要由抗原中的某一个或几个表位所诱导。因此我们推测基于同一保护性抗原的亚单位疫苗，辅以不同的佐剂或同一佐剂的不同免疫途径，所产生的免疫保护效果差异可能由于特异性CD4+T细胞对应显性表位应答的不同所造成。 Hp尿素酶被证实与Hp的感染、定植密切相关，其通过分解尿素产氨以中和胃粘膜局部的H+，产生适于Hp定植的微环境。尿素酶包含两个亚基即A亚单位（UreA）和B亚单位（UreB）。其中UreB可诱导机体产生强烈的免疫应答，且核苷酸和氨基酸序列高度保守是目前公认的Hp保护性抗原。因此本课题选取UreB作为研究对象，分别辅以弗氏佐剂、CpG和AddaVax三种不同佐剂进行皮下免疫接种，以及CpG佐剂的皮下和滴鼻两种途径免疫小鼠，采用步移合成重叠肽方法和细胞内因子染色、流式细胞术等对特异性CD4+T细胞的显性表位应答特性进行分析。探寻不同佐剂或免疫途径下表位特异性优势应答的差异，揭示不同佐剂或免疫途径下免疫保护作用差异的内在原因。 目的： 以UreB为研究对象，通过对特异性CD4+T细胞的显性表位优势应答特性分析为同一保护性抗原的不同佐剂疫苗或同一佐剂疫苗的不同免疫途径所产生的保护效果差异提出新的解析，为基于表位设计的Hp疫苗研究提供候选分子和实验依据，也为Hp疫苗的保护性应答监测提供有效方法。 方法： 1、幽门螺杆菌培养。 选择在BALB/c小鼠模型中定植量较高的幽门螺杆菌菌株B6进行培养。调整细菌浓度为109CFU/ml用于感染攻毒。 2、小鼠免疫攻毒。 分别采用CpG，AddaVax，弗氏佐剂联合UreB抗原皮下注射免疫小鼠。CpG分别采用皮下和滴鼻进行免疫。表位免疫均采用滴鼻免疫，佐剂选择CpG。末次免疫后1周行Hp攻毒。 3、特异性抗体检测。 采用ELISA法分别检测血清和胃粘膜局部的IgG抗体和IgA抗体。判断其体液免疫应答情况。 4、胃粘膜Hp定植量检测 末次攻毒后4周，提取小鼠胃粘膜局部DNA，采用实时定量PCR检测幽门螺杆菌16SrDNA。判断胃粘膜局部Hp定植情况。 5、特异性T细胞扩增。 收集免疫后小鼠的脾脏，研磨成单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞，在白介素存在的条件下体外经抗原或肽刺激进行特异性T细胞的扩增。 6、诱导小鼠骨髓源DCs与递呈实验。 收集小鼠骨髓，制成单细胞悬液后裂解红细胞，剩余细胞在相应细胞因子的刺激下分化发育为DCs。成熟的DCs预负载抗原1h后与特异性细胞共培养，用于递呈实验。 7、细胞内因子染色。 在高尔基体阻断剂存在的条件下，采用合适的刺激物刺激特异性细胞合成细胞因子5h，之后用荧光抗体标记细胞表面分子及细胞内因子。最后进行流式分析。 8、数据分析 胃粘膜局部Hp定植量检测采用非配对T检验。其它数据均采用单因素方差分析。所有数据均采用平均数±标准差表示。p≤0.05视为有统计学意义。 结果： 1、UreB联合不同佐剂免疫小鼠可诱导产生有差异的免疫保护作用。CpG疫苗滴鼻组和弗氏佐剂疫苗皮下注射组小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定植量较其它免疫组和PBS对照组显著降低（P0.01），而其它免疫组与PBS对照组相比无显著差异，但CpG疫苗皮下组、AddaVax疫苗皮下组的Hp定植数量略低于PBS对照组。 2、体外从抗原免疫组小鼠脾脏中成功扩增出抗原特异性CD4+T细胞，其比例可达到10%，而未免疫组即PBS对照组未见阳性信号。 3、从UreB抗原中筛选到4个优势应答表位，AddaVax佐剂皮下免疫组优势应答表位为UreB485-497（AKYDANITFVSQA），而弗氏佐剂及CpG佐剂皮下免疫组均可诱导产生针对UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）和UreB409-421（YTINPAIAHGISE）的表位特异性细胞应答， CpG佐剂滴鼻免疫组优势应答表位为UreB373-390（ITRTWQTADKNKKEFGRL）。 4、显性表位UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）、UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA）的应答均可被MHC-Ⅱ（I-A）单克隆抗体特异性阻断。 5、对显性表位进行免疫保护性评估发现UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）表位免疫组胃粘膜Hp定植量显著降低（P＜0.001），而表位UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA）免疫组与PBS对照组相比无统计学差异。 结论： 1、针对同一保护性抗原应用不同的佐剂可诱导机体产生不同的表位特异性CD4+T细胞优势应答。 2、针对同一保护性抗原，，同一佐剂的不同免疫途径可激发机体产生不同的表位特异性CD4+T细胞优势应答。 3、采用步移合成重叠肽法，从UreB中筛选鉴定出4个新的Th显性表位UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）、UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA），可通过MHC-Ⅱ（I-A）限制性自然递呈，并诱导Th1细胞优势应答。 4、四个Th显性表位中UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）具有显著的抗Hp感染的免疫保护作用。
【关键词】：幽门螺杆菌 尿素酶B亚单位 Th表位 免疫佐剂
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378;R392
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-10
• 摘要10-14
• 1.前言14-16
• 2.实验材料16-20
• 3.实验方法20-32
• 4.结果32-47
• 5.讨论47-51
• 全文总结51-52
• 本研究的创新、不足和展望52-53
• 参考文献53-57
• 文献综述 幽门螺杆菌尿素酶 B 亚单位相关疫苗的研究进展57-65
• 参考文献62-65
• 在读期间发表的论文65-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 孙波,杨骅,李兆申,屠振兴,龚燕芳,杜奕奇;幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究[J];第二军医大学学报;2005年06期

2 袁小澎;邹全明;柏杨;张卫军;郭刚;谢庆华;刘开云;吴超;;幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性[J];中国生物制品学杂志;2007年07期

3 袁小澎;邹全明;洪愉;柏杨;吴超;张卫军;;幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究[J];中国免疫学杂志;2007年08期

本文编号：744601