SLC3A2慢病毒载体的构建及其转染精子细胞的研究

发布时间：2017-08-29 11:05

  本文关键词：SLC3A2慢病毒载体的构建及其转染精子细胞的研究

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【摘要】：背景及其目的：精子载体法自运用于制备转基因动物以来，它具有操作简单和费用较少的特点；精子自发吸收外源DNA的天然特点，能使外源基因保持较好的完整性。慢病毒载体利用病毒能将基因整合进宿主细胞基因组，并能稳定遗传的特点，使之成为制备转基因动物的主要工具之一。将精子与慢病毒载体共同孵育，探讨外源基因带入精子细胞的效率，优化筛选出最佳条件，为制备转基因小型猪动物模型奠定基础，，为相关研究参考依据。 方法:1）利用基因工程技术将目的基因SLC3A2序列片段连接到LV5载体上，构建其基因重组载体，然后进行病毒包装，最后用荧光定量PCR进行病毒滴度的测定。2）将含基因SLC3A2慢病毒载体与精子细胞在不同条件下进行孵育。1、不同浓度的（104IU/ml，105IU/ml，106IU/ml）慢病毒载体与精子细胞孵育；2、慢病毒载体与精子分别孵育不同时间（1h，2h，3h，4h）；3、慢病毒载体与精子分别在不同温度（17℃，25℃，37℃）下孵育；4、不同浓度（0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL）的Polybrene与慢病毒载体和精子孵育。3）利用免疫荧光法和半定量PCR法检测在不同条件下，慢病毒载体与精子孵育的转入外源基因的效率；4）用镜检法检测在不同条件下，慢病毒载体与精子孵育的精子细胞活力。 结果：1)构建了LV5-SLC3A2重组载体，通过酶切鉴定和测序报告判定载体构建成功。2）测定的慢病毒载体的平均滴度为2.03×108IU/ml。3）经过PCR和免疫荧光法检测后发现：SLC3A2在105IU/ml，106IU/ml条件下的水平较高；在孵育2小时后SLC3A2均有表达；SLC3A2在不同温度下均有表达；慢病毒载体和精子细胞与10μg/mL和15μg/mL的Polybrene孵育后，SLC3A2的水平最高。4）3h，4h组精子细胞活力显著低于1h组；17℃组的精子活力较高；15μg/mL的Polybrene和106IU/ml组的精子活力较低。 结论：1）成功构建了SLC3A2慢病毒载体。2）精子细胞和105IU/ml慢病毒载体在17℃条件下，与10μg/mL的Polybrene共孵育2h时，外源基因SLC3A2转导效率最佳。
【关键词】：精子载体法 慢病毒载体 SLC3A2
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 主要英文缩略词6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-13
• 实验材料13-18
• 1.1 细胞株13
• 1.2 实验菌株和质粒13
• 1.3 主要试剂与仪器13-15
• 1.4 培养基配置15-16
• 1.5 常规试剂配置16-18
• 实验方法18-30
• 2.1 PCR 方法扩增 SLC3A2 基因18-21
• 2.2 目的基因 SLC3A2 克隆到载体 LV5 中21-25
• 2.3 重组质粒测序验证并大量抽提25
• 2.4 慢病毒包装及病毒滴度检测25-27
• 2.5 精子与慢病毒载体孵育法27
• 2.6 提取精子细胞基因组27-28
• 2.7 用 PCR 检测精子与慢病毒载体孵育后 SLC3A2 的水平28-29
• 2.8 免疫荧光法检测不同条件对精子与慢病毒载体孵育的影响29
• 2.9 检测精子活力29
• 2.10 统计学分析29-30
• 实验结果30-45
• 3.1 SLC3A2 慢病毒载体的构建30-33
• 3.2 检测在不同条件下慢病毒载体与精子孵育后 SLC3A2 的水平33-42
• 3.3 检测在不同条件下慢病毒载体与精子孵育对精子活力的影响42-45
• 讨论45-49
• 结论49-50
• 参考文献50-54
• 文献综述54-61
• 参考文献58-61
• 研究成果61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;Beyond Mice:Genetically Modifying Larger Animals to Model Human Diseases[J];遗传学报;2012年06期

2 Nana Fan;Liangxue Lai;;Genetically Modified Pig Models for Human Diseases[J];遗传学报;2013年02期

本文编号：752923