电离辐射诱导线粒体相关基因表达的改变及相互作用的研究

发布时间：2017-08-31 09:35

  本文关键词：电离辐射诱导线粒体相关基因表达的改变及相互作用的研究

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【摘要】：目的： 线粒体是细胞氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)的场所,线粒体DNA是细胞内唯一的核外遗传物质,编码37个基因(22个tRNA基因、2个rRNA基因和13个多肽基因),参与细胞OXPHOS和能量代谢且合成ATP,为细胞的生命活动提供直接能量。 目前发现线粒体基因组相比于核基因组的拷贝数高,复杂程度低,对电离辐射也更加敏感。线粒体功能的实现受到核基因组的调控,同时核基因组和线粒体基因组相互协调维持细胞内正常的ATP水平。在本实验室前期对电离辐射诱导的线粒体编码基因表达变化研究中,发现电离辐射诱导的COX基因(由3个线粒体编码基因和10个核基因组编码基因组成)表达变化比较明显,为研究电离辐射诱导的核基因组和线粒体基因组相互作用提供了科学依据。 本课题就是探索电离辐射诱导人正常细胞的线粒体编码基因COX Ⅰ、 COX Ⅱ与线粒体相关核编码基因NRF-1、mtTFA、COXⅣ、COXVb的表达变化,进而观察mtTFA敲低后这些基因表达改变,并探讨与细胞活性和ATP浓度之间的关系,初步探索电离辐射诱导线粒体基因组与核基因组之间的相互作用,为了解电离辐射诱导的分子生物效应提供新的实验资料,为辐射损伤敏感标志物的筛选提供科学依据。 方法： 1.以剂量率为1Gy/min的60Coγ射线(剂量为0、1、3、5、8、10和15Gy)对人淋巴细胞株AHH-1和人正常肝细胞株L02进行照射,照射后培养24h和48h,分析COX Ⅰ、COX Ⅱ、NRF-1、mtTFA、COXⅣ、COXⅤb的表达变化。用实时荧光定量PCR的方法分析转录水平的表达变化,用Western blot检测其蛋白水平的变化。AHH-1测定细胞活性；L02测定ATP浓度和细胞活性。 2.用RNA干扰技术敲低mtTFA后,不同剂量(0-15Gy)60Coγ射线照射L02肝细胞,24h、48h后用实时荧光定量PCR的方法检测线粒体基因NRF-1、 mtTFA、COX Ⅰ、COX Ⅱ、COXⅣ、COX Ⅴb的转录水平表达变化；Western blot检测敲低前后其蛋白水平表达变化；同时测定ATP浓度和细胞活性。 结果： 1.60Coγ射线照射人淋巴细胞AHI-I-1后,COX Ⅰ转录水平在24h、48h的0-5Gy范围内呈现较好的剂量效应关系；COX Ⅱ转录水平在24h的0-15Gy表达水平显著增强,呈现较好的剂量效应关系；mtTFA转录水平在24h、48h的0-15Gy呈现较好的剂量效应关系；其他基因COXIV、COXⅤb、NRF-1表达变化不明显。 2.60Coγ射线照射人正常肝细胞L02后,相比于对照组的24h、48h mRNA水平,NRF-1、mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ、COXⅣ、COXⅤb总体上调,均具有较好的剂量效应关系。mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ转录水平表达在24h的0～10Gy范围内呈现良好的剂量效应关系,10Gy剂量水平诱导的表达增强最显著：COXⅣ和COXⅤb转录水平农达在0-5Gy范围内呈现良好的剂量效应关系,5Gy剂量水平诱导的表达增强最显著：COXⅠ基因转录水平表达在48h的0-8Gy范围内呈现良好的剂量效应关系,8Gy表达增强最显著。照射后24h的蛋白水平分析,mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ总体上调,均具有较好的剂量效应关系;48h蛋白水平分析,mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ总体上调,但剂量效应关系不明显； 3.用RNA干扰技术成功敲低L02的mtTFA后,相比于对照组的照射24h、48h后mRNA水平,NRF-1、mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ、COXⅣ、COXⅤb总体上调;但相比于未敲低之前,COX Ⅰ、COX Ⅱ mRNA水平降低,COXⅣ、COX Vb mRNA水平上调,NRF-1表达变化不明显；L02照射后ATP浓度随剂量增加,浓度升高,细胞活性下降；而用RNA干扰技术敲低mtTFA后,ATP浓度随剂量增加,浓度升高,但相比未敲低组,ATP浓度下降。 结论： 1.在转录水平上,60Coγ射线照射后24h和48h,人正常肝细胞线粒体基因NRF-1、mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ、COXⅣ、COXⅤb表达水平总体上调,6种线粒体基因均有各自不同的最佳诱导剂量； 2.电离辐射诱导的L02线粒体基因在调控通路上,mtTFA调控线粒体编码的基因COX Ⅰ、COXⅡ而不参与调控核基因编码的COXⅣ、COXⅤb,需进一步研究NRF-1调控核基因编码的通路。 3.电离辐射诱导L02细胞ATP浓度随着剂量增加而增加,而RNA干扰mtTFA后,其ATP浓度随着剂量增加而增加,但相比于RNA干扰前(?)ntTFA下降比较明显,可能受线粒体编码的基因COX Ⅰ、COX Ⅱ下调影响。 本研究在揭示了电离辐射诱导的线粒体基因与核基因表达基础上,确定了辐射对人正常肝细胞的杀伤作用以及时间响应范围；利用小RNA瞬时敲低mtTFA COX Ⅰ、COX Ⅱ表达也随之下调,同时引起细胞ATP浓度的降低,并导致细胞活性异常,证明了mtTFA在电离辐射诱导下是作为COX Ⅰ、COX Ⅱ的上游调控基因；核编码的基因mtTFA以及线粒体编码的基因COX Ⅰ、COX Ⅱ在影响ATP浓度的改变中发挥重要作用,提供了提高辐射敏感性研究的资料；同时由于凋亡的发生与肿瘤的发生密切相关,调节细胞的凋亡是治疗肿瘤的重要方法之一,提示通过敲低肝癌细胞的线粒体基因来提高肿瘤放射敏感性。
【关键词】：~60Coγ射线 人淋巴细胞 人正常肝细胞 线粒体基因表达 相互作用
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文缩略词表12-14
• 前言14-21
• 材料与方法21-37
• 1. 实验材料21-27
• 1.1 材料及试剂配制方法21-22
• 1.2 主要试剂22-23
• 1.3 试剂配方23-26
• 1.4 仪器设备26-27
• 2. 实验方法27-37
• 2.1 细胞培养及传代27
• 2.2 细胞株外照射及计数27-28
• 2.3 RNA干扰28
• 2.4 质粒DNA的大量制备28-29
• 2.5 细胞瞬时转染29-30
• 2.6 细胞总RNA的提取30
• 2.7 逆转录PCR30-32
• 2.8 琼脂糖凝胶电泳检测32
• 2.9 实时荧光定量PCR32-33
• 2.10 细胞蛋白样品处理33
• 2.11 Western Blot印迹法33-35
• 2.12 细胞活性及ATP浓度测定35-36
• 2.13 统计学处理36-37
• 结果37-57
• 第一部分 ~(60)Coγ照射后人淋巴细胞线粒体基因在转录水平上的表达变化37-43
• 第二部分 ~(60)Coγ照射后人正常肝细胞线粒体基因在转录水平上的表达变化43-51
• 第三部分 ~(60)Coγ照射后人正常肝细胞线粒体基因在翻译水平上的表达变化51-55
• 第四部分 ~(60)Coγ照射后人淋巴细胞和人正常肝细胞的ATP浓度和细胞活性55-57
• 讨论57-62
• 结论62-63
• 参考文献63-68
• 致谢68-69
• 综述：microRNA作为电离辐射生物标志物的研究现状69-79
• 参考文献75-79
• 作者简介79

【参考文献】

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本文编号：764830