发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗初步研究

发布时间：2017-08-31 22:21

  本文关键词：发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗初步研究

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【摘要】：发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是近年在我国新发现的一种布尼亚病毒,病人的主要症状为发热、血小板减少、白细胞减少、消化道症状和多脏器功能损伤。目前已在河南、湖北、山东、江苏、安徽、辽宁等16个省发现发热伴血小板减少综合征(SFTS)病例,病人平均死亡率在10%左右。目前尚没有有效的疫苗可以使用,研制安全有效的预防用疫苗成为了应对SFTS疫情的迫切需要。 根据我国SFTS疫情的分布特点,筛选了源自7个省的7株SFTSV疫苗候选株。首先完成病毒空斑纯化,Vero细胞传代扩增,滴度均达到108TCID50/ml以上,其中HB29株和AH12株的滴度最高,分别为108.67TCID50/ml和108.91TCID50/ml。分别接种这7株SFTSV于Vero细胞,大量扩增后收获的病毒液经β-丙内酯灭活后,采用低速离心、过滤、超滤浓缩、20%蔗糖垫层超速离心等步骤纯化病毒,得到了纯度和浓度均较高的病毒颗粒。首先优化确定了动物实验的免疫程序,然后将这七株纯化后的SFTSV分别配制成含铝佐剂的疫苗,采用相同的免疫剂量和免疫程序分别免疫两只新西兰大白兔,采0天、14天、28天、42天的兔血清做微量交叉中和试验和空斑减少交叉中和试验,结果显示免疫HB29株抗血清的免疫原性和交叉保护能力最好,对7株SFTSV的中和抗体几何平均滴度为1159(空斑减少中和试验)和538(微量中和试验),其次是AH12株抗血清,中和抗体平均几何滴度为861(空斑减少中和试验)和302(微量中和试验)。遗传稳定性分析结果显示,7株SFTSV在Vero细胞上传代10次后核酸的同源性依然保持在100%。因此,HB29和AH12都比较适合作为疫苗生产用毒株。 对SFTSV灭活疫苗疫的制备条件进行了探索。优化确定了细胞病毒接种比例。用无血清DMEM.无血清M199、含2%胎牛血清的DMEM和含0.5%人血清白蛋白的DMEM几种不同培养基,以0.01MOI的病毒量感染Vero细胞,比较了这几种不同培养基中病毒的增殖动态,确定了采用无血清DMEM作为SFTSV疫苗生产用培养基。比较了p-丙内酯和福尔马林在不同浓度下对SFSTV的灭活情况,确定了p-丙内酯在1：2000或1：4000的使用浓度下既可以灭活病毒,又对病毒的保护性抗原没有损伤,为最佳的灭活条件。我们也对SFTSV的分子筛层析方法进行了初步探索。 由于该病毒是一种全新的病毒,在疫苗研制过程中所需要建立一些新的实验方法。本研究建立了基于核蛋白双抗体夹心法ELISA的SFTSV滴定方法,并与空斑滴度法和免疫荧光法进行比较验证,三种方法具有较好一致性。建立了用于SFTSV疫苗毒株检定的鉴别试验。采用固定血清稀释病毒的中和试验方法。制备并鉴定了13株SFTSV糖蛋白单克隆抗体,建立了双抗体夹心检测SFTSV糖蛋白的ELISA方法。
【关键词】：发热伴血小板减少综合征病毒 疫苗候选株 制备条件 检测方法
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 前言8-10
• 第一部分 发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗候选株的筛选10-41
• 1. 引言10-11
• 2.实验材料11-13
• 3. 实验方法13-25
• 4. 实验结果25-38
• 5.讨论38-39
• 6. 参考文献39-40
• 7. 单元小结40-41
• 第二部分 发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗制备相关条件探索41-64
• 1. 引言41-43
• 2. 实验材料43-45
• 3. 实验方法45-49
• 4. 实验结果49-61
• 5. 讨论61-62
• 6. 参考文献62-63
• 7. 单元小结63-64
• 第三部分 发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗研究相关检测方法的建立64-89
• 1. 引言64-65
• 2. 实验材料65-68
• 3. 实验方法68-75
• 4. 实验结果75-85
• 5. 讨论85-87
• 6. 参考文献87-88
• 7. 单元小结88-89
• 攻读硕士期间已发表文章89-90
• 致谢90

【参考文献】

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1 姜晓林;王显军;李建东;丁淑军;张全福;曲靖;张硕;李川;芜为;姜梅;梁米芳;毕振强;李德新;;家养动物体表蜱中发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒分离及鉴定[J];病毒学报;2012年03期

2 张文璇,石慧颖,张晋,丁志芬;应用区带离心法纯化地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗[J];中国生物制品学杂志;2004年03期

3 白玉;李敏;高恩明;;病毒灭活疫苗生产工艺要点[J];中国生物制品学杂志;2011年09期

4 宋宗明,岳立广,钱依群,刘双军,李彤,赵红丽,洪成龙,韩亮;柱层析法制备乙型脑炎纯化疫苗的研究[J];微生物学免疫学进展;2004年03期

5 石慧颖,丁志芬,赵敏,庞成华,杨抗抗,李荆;大规模区带离心纯化Vero细胞乙脑疫苗[J];中国病毒学;1998年03期

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本文编号：768270