柯萨奇病毒A组16型减毒疫苗候选株的筛选

发布时间：2017-09-02 01:42

  本文关键词：柯萨奇病毒A组16型减毒疫苗候选株的筛选

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【摘要】：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)的重要病原体之一,可引起婴幼儿发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹,亦可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等,严重者可致死。近年来,我国HFMD的发病人数呈逐年上升趋势,严重威胁着婴幼儿的健康成长。 目前对于HFMD的治疗尚无特效药物,虽然绝大部分患者预后较好,但少数重症病例可合并心肌炎、脑炎等。因此,疫苗是预防该类疾病最有效的手段。肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)灭活疫苗经临床试验验证保护效果十分理想,有望用于预防EV71引起的HFMD,为了能够全面预防HFMD的发生,CA16疫苗的研发成为迫切需要解决的问题。 本研究对临床获得的HFMD患者的粪便及咽拭子标本进行病毒的分离及鉴定,结果共获得7株CA16病毒。对包括FY18、KMM/08、KM208在内的10株病毒进行研究,并将其分为两个部分。 第一部分为生物学特性的分析。此部分对病毒的生长特性、蚀斑形态、毒力以及对乳鼠组织的病理改变等生物学特性进行了分析。10株病毒除FY18基因型为A型外,另9株均属于Bl亚型,其中5株为Blb型、4株为B1a型；氨基酸序列分析发现存在多个差异位点,尤以第98位和第241位较典型；在Vero细胞上增殖较快,多数毒株4-6天即可达到增殖高峰,但感染性滴度相差较大,最低为4.751gCCID5o/ml,而最高可达7.781gCCID50/ml：各毒株在Vero细胞上培养相同的时间形成的蚀斑形态不一,其中KM15、KM154、KM168蚀斑呈圆形,针尖样大小,边缘较清晰,FY18蚀斑较上述3株病毒更加细小均匀,形状规则,KM1、KM881、KM263、KM165、KMM/08、KM208蚀斑则较大,不规则,边缘较模糊；各毒株毒力均较强,乳鼠颅内注射病毒后,均于3-6天陆续开始发病,除KM168、KM154、KM15三组乳鼠为不同程度的发病及死亡外,其他组乳鼠发病率及死亡率均达到100%；各毒株对乳鼠的脑、心、肺、肌肉、脊髓和肝脏等组织都有不同程度的损伤,其中损伤较严重的组织为脑和肌肉。 第二部分为减毒疫苗候选株筛选。将上述所得的10株病毒接种于KMB17细胞上经连续低温传代的方式进行减毒,通过感染性滴度、抗原含量、致病性、免疫原性等多项评价指标对毒株进行筛选。KM165传代至KP2时感染性滴度仍过低(3.751gCCID50/m1),不再进行后续研究；病毒传代至KP4时除FY18外其余毒株毒力都有不同程度的减弱,但FY18、KM1、KM263免疫原性较差,不再进行筛选；组织内病毒载量测定发现,病毒感染乳鼠后,可经血液扩散到全身多个组织器官,并以肌肉作为主要增殖场所,通过肠道排出体外；至KP7时,剩余的6株病毒感染性滴度均大于6.001gCCID50/m1,KM154、KM168则大于7.001gCCID50/m1,均能诱导机体产生抗体;后经蚀斑克隆纯化获得73个克隆株,根据感染性滴度、抗原含量、免疫原性、对乳鼠的残余毒力及前期的研究结果初步筛选出KP11的KM168-8、KM154-62个克隆株作为候选株进行后续的研究。因此下一步还需要对这2个克隆株进行二次克隆纯化筛选,同时进行感染性滴度、抗原含量、致病性、免疫原性、遗传稳定性及热稳定性系统性研究以建立真正符合要求的减毒疫苗候选株。
【关键词】：手足口病 柯萨奇病毒A组16型 生物学特性 减毒活疫苗
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-19
• 一 HFMD及CA16流行情况10-12
• 二 CA16基因结构及其分型12-13
• 三 病毒感染与繁殖13-14
• 四 临床症状及致病机制14-15
• 五 HFMD的药物治疗及预防15-16
• 六 CA16疫苗研究现状16-17
• 七 课题研究目的、意义和思路17-19
• 材料与方法19-31
• 一 实验材料19-23
• 1 实验动物19
• 2 毒株19
• 3 样品及细胞来源19
• 4 主要试剂及配制方法19-22
• 5 所用材料22
• 6 主要仪器22-23
• 二 实验方法23-31
• 1 细胞培养23
• 2 病毒分离23-24
• 3 病毒培养24
• 4 病毒鉴定24-25
• 5 感染性滴度检测及病毒生长特性分析25-26
• 6 ELISA检测CA16抗原含量(双平行线法)26
• 7 病毒蚀斑形态分析26-27
• 8 病毒致病性检测27
• 9 免疫原性检测27-28
• 10 乳鼠组织内病毒载量的测定28-31
• 结果与分析31-51
• 一 CA16生物学特性分析31-40
• 1 病毒分离及鉴定情况31-36
• 2 病毒生长特性分析36-37
• 3 病毒蚀斑形态分析37-38
• 4 病毒致病性评价38-40
• 二 CA16减毒疫苗候选株筛选40-51
• 1 35℃低温传代40-42
• 2 33℃低温传代42-51
• 讨论51-55
• 一 CA16生物学特性分析51-53
• 二 CA16减毒疫苗候选株筛选53-55
• 小结55-57
• 参考文献57-61
• 缩略词表61-62
• 致谢62-63
• 个人简历63-64

【参考文献】

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本文编号：775670