艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶及二元毒素的原核表达、纯化

发布时间：2017-09-04 16:36

  本文关键词：艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶及二元毒素的原核表达、纯化

  更多相关文章： 艰难梭菌 谷氨酸脱氢酶 二元毒素 重组表达 蛋白纯化

【摘要】：目的:艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile，CD）是院内感染性腹泻最主要的病原菌之一。2010年美国卫生保健流行病学协会和感染病协会颁布针对难辨梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的临床诊治指南。英国把CDI列为强制上报和管理病例。国内对于CDI报道较少，原因可能是没有快速可靠的检测方法，，而进口检测试剂价格昂贵且国家药监局还没有批准有关CD的任何检测试剂。国外对CDI的检测最常用的是酶免疫法（enzyme immunoassay，EIA）检测谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）作为初筛，并联合检测毒素A/B。GDH是CD产毒株与非产毒株的共同抗原，其产量高，GDH检测灵敏度高，且出结果快速，是一种高效的初筛方法。新分离的高毒株亚型BI/NAP1/027产生一种新的二元毒素(Clostridium difficiletransferase，CDT)，被认为是该毒株引起高发病和高死亡的最主要原因。CDT包括两个独立的蛋白亚基：具有酶活性的CDTa和具有结合能力的CDTb。最新研究表明感染产CDT合并TcdA和TcdB菌株的死亡率明显高于只产TcdA或/和TcdB的菌株。从一定意义上证实了CDT检测对于CD临床病例管理，病人获得早期及时有效的治疗以及疾病的预后转归有重要作用。目前没有能够同时针对GDH、毒素A/B的检测方法，更没有针对CDT的快速检测方法，本课题拟通过CD标准株的厌氧培养，分子克隆技术构建GDH及CDTa/b的重组表达质粒，原核表达并纯化目的蛋白，通过制备GDH和CDTa/b的单克隆抗体，为CDI的快速检测方法研究打下基础。 方法:厌氧培养CD标准株ATCC BAA-1805，提取CD基因组DNA作为分子克隆模板。采用PCR从模板DNA中扩增得到目的基因GDH、CDTa和CDTb，将目的基因分别克隆至表达载体pET-28a(+)，pET-32a(+)中。成功构建的原核表达重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE、Western blot分析及Ni-NAT层析柱分离纯化后，GDH蛋白根据脱氢酶酶活测定方法，测定其酶活性浓度。将纯化的GDH、CDTa和CDTb免疫小鼠，检测小鼠血清抗体效价，选择效价高的小鼠进行细胞融合，制备单克隆抗体。 结果:成功培养出艰难梭菌。通过分子克隆技术成功构建重组表达质粒pET-28-GDH，pET-32-CDTa和pET-32-CDTb。通过原核表达技术得到目的蛋白，表达产物经SDS-PAGE分析可见GDH在相对分子量约46kDa处，CDTa在70kDa处，CDTb在97kDa处有相应条带，Westernblot分析均可与抗His单抗特异性结合，经亲和层析柱纯化后，GDH纯度可达90%，浓度为1.7mg/ml，GDH以NADPH和NADP为辅酶，酶活性浓度分别为42.6U/L和63.3U/L。CDTa和CDTb经纯化后，伴有少量杂蛋白，CDTa和CDTb纯度分别为70%和60%，浓度分别为1.3mg/ml和1.0mg/ml。纯化的目的蛋白免疫小鼠后，小鼠均产生了抗血清，抗血清滴度为1:105。选取GDH免疫的小鼠进行细胞融合，遗憾的是，最终目的未能筛选出可应用于GDH检测的杂交瘤细胞。 结论: pET-28-GDH的重组工程菌能够稳定高效、可溶性地表达目的蛋白，纯化的目的蛋白纯度高，具有谷氨酸脱氢酶酶活性，为制备GDH单克隆抗体奠定基础。pET-32-CDTa与pET-32-CDTb重组质粒表达产物产量相对较少，且含有杂蛋白，可进一步通过优化IPTG浓度、诱导表达温度优化表达条件，CDTa、CDTb可通过离子交换层析法，或通过Superdex200分子筛亲和层析法优化纯化条件。
【关键词】：艰难梭菌 谷氨酸脱氢酶 二元毒素 重组表达 蛋白纯化
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-17
• 1 材料与方法17-35
• 2 结果35-46
• 3 讨论46-49
• 全文总结49-50
• 参考文献50-52
• 文献综述52-62
• 参考文献57-62
• 致谢62-63
• 攻读硕士学位期间发表论文63
• 攻读学位期间参加学术会议63-64

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 罗珊;刘文恩;;艰难梭菌致病相关研究进展[J];国际检验医学杂志;2013年19期

本文编号：792649