血小板活化功能及血小板微粒对重型血友病A临床表现异质性影响的研究

发布时间：2017-10-11 17:11

  本文关键词：血小板活化功能及血小板微粒对重型血友病A临床表现异质性影响的研究

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【摘要】：背景和目的血友病A是一种较罕见的X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病,据世界卫生组织(WHO)和世界血友病联盟(WFH)调查,血友病A的发病率约为1/10000,其中重型血友病A的发病率约为1/16000,全球中重型血友病患者共350000人，，我国估计病例10-13万人。血友病A的发病基础是凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷导致的Ⅷ因子水平(FⅧ:C)和(或)功能减低而使血液不能正常凝固,其主要的临床表现为自发性关节和组织出血,以及出血引起的畸形。目前我国主要根据血浆中FⅧ/FIX活性值进行临床分型,分为亚临床型、轻型、中型和重型,因轻中型病例漏诊率高,统计显示重型患者高达60-70%[21。在未经治疗的情况下,重型血友病患者平均每月可发生1-6次自发性关节、肌肉及软组织出血,反复的关节出血引起的关节滑膜炎、软骨破坏、骨性关节炎、肌肉萎缩等病变使关节功能丧失而致残,而且慢性血友病关节疼痛、活动障碍降低了患者的生活质量,除血友病性关节病外,骨筋膜室综合征、假性肿瘤、重要脏器出血等为血友病患者常见的危险并发症。血友病的出血频率及严重程度往往与其凝血因子水平相关,患者出血时的治疗目前仍为外源性凝血因子替代治疗为主,维持足够时间的预防治疗和尽早、足量的按需治疗成为阻止关节残疾进展的主要策略。反复的出血事件及并发症的治疗给患者带来了极大的经济负担。医疗条件、经济承受能力、药物来源等问题是制约治疗水平的主要因素。国内外文献及我们的前期工作均发现,即使是血浆凝血因子水平相同的患者,其出血的严重程度及出血频率、外源性凝血因子需求也可能存在显著的差异,通过监测患者出血事件的频率或凝血因子输注情况,约10-15%的重型血友病A患者仅表现为轻度出血(年出血≤6次/年),国外文献报道中van Dijk,K等也发现,如果不经治疗,有些病人年出血事件可达96次,而另外一些人则很少出血,这种现象被称为重型血友病的临床表现异质性.我们前期工作也已经证实了存在异质性的现象,李含[4]通过分析223例重型患者的资料发现：我国华南地区重型血友病A患者临床表现具有明显的异质性,轻度表型占12.9%；15岁以上无关节畸形者约9.3%。这种临床表现异质性的机制至今尚不明确,血友病虽为单基因突变的遗传性疾病,但其临床表现是遗传和环境等多种因素共同影响的结果,仅是基因表型不能解释重型患者轻度出血表型的现象。在Santagostino等的研究中,通过凝血酶生成试验检测重型血友病患者血浆促凝及抗凝活性,证实重型患者临床表现异质性与促凝及抗凝活性差异相关,提示FⅧ活性不是衡量临床分型的唯一因素,也表明血浆凝血因子水平并不能完全准确衡量和预测患者的出血风险、治疗需求和长期预后,其它可能还存在的对临床表现产生影响的因素值得我们探究。结合国内外已有研究结果和我们先前的工作发现,影响重型血友病A临床表现异质性可能是(1)FⅧ基因突变类型；(2)促凝与抗凝蛋白的活性相关的因素(如FⅧ药代动力学、vWFAg水平、纤溶酶原活性)； (3)出血症状有关因素(如首次出血年龄、首次关节出血年龄、靶关节数目、关节功能状况)；(4)其他因素(如体力活动水平、身体质量指数、血管活性、心理状态等)相关。正常的凝血过程中,血小板起着至关重要的作用。国外Beatrice Cambien等认为P-选择素能通过促进血小板聚集,纤维蛋白的形成从而促进止血。VanBladel等发现轻中型血友病A患者的血小板活性较重型患者的明显升高。血小板活化后质膜翻转形成血小板微粒,膜磷脂表面暴露,提供大量凝血因子结合表位,促进凝血酶生成从而促凝血。血小板微粒作为活化后的产物,在局部扩大了活化反应并将信息向远处传递,增加远处血小板活化水平。HrachovinovaI等在小鼠上证实P-选择素与其配体PSGL-1相互作用而促进微粒的产生[9]。结合国外在其它领域多证实MPs促凝作用的事实,我们假设重型患者血小板活化水平、PMPs水平存在差异,这种差异可能通过影响凝血过程而对重型血友病A患者临床表现产生影响。我们的前期工作筛选分析了广东省血友病病例信息管理中心登记223例重型血友病A患者的出血情况,发现在重型患者中临床表现确实存在异质性。本实验拟研究临床表现存在异质性的两组重型血友病A患者(重型血友病A轻度表型组和重型血友病A重度表型组)不同状态下血小板活化功能及血小板源性微粒(PMPs)数目的变化,探讨P-选择素、MPs与临床表现异质性的关系及其机制,为明确重型血友病A患者临床表现异质性形成原因、完善个体化治疗决策提供依据,也可能拓展血友病非凝血因子治疗的新途径。方法一、流式细胞术血小板活化功能检测：1.1病例资料：根据Bethil TC分型方案,以FⅧ活性(FⅧ:C)2%界定重型血友病A患者,2012年2月至2014年4月间,从广东省血友病病例信息管理中心筛选登记的有完整病史资料的367例患者中,选取符合年龄大于18岁、因子替代治疗方案均为按需治疗,试验前72小时内无出血事件、无用药记录,排除FⅧ抑制物阳性(Bethesda法0.6BU)患者及合并其他基础疾病的重型血友病A患者。经知情告知,有31名患者符合要求并自愿加入本项研究,另招募有17名健康男性志愿者自愿加入本试验,均签署知情同意书。根据患者自发性出血频率,分别以出血频率6次／年、24次／年为分界点,定义近2年来患者自发性年出血频率≤6次／年为重型血友病轻度表型,24次／年为重型血友病重度表型[4],其中轻度表型10人,重度表型21人,健康成年男性志愿者17人为正常对照。各组年龄、体重均匹配。受试者BMI在正常范围。1.2主要仪器与试剂：1.2.1主要仪器：Thermo高速离心机(美国Thermo公司)、流式细胞仪检测(CantoII,美国Becton Diekson公司),血液细胞XE-2100M分析流水系统(SYSMEX,上海)。1.2.2主要试剂：Mouse IgG1-PE(美国Becton Diekson公司)、CD41a-APC(美国Becton Diekson公司)、CD42b-PE(美国Becton Diekson公司)、CD61-FITC(美国Becton Diekson公司)、CD62P-PE(美国Becton Diekson公司)、CD63-PE(美国Becton Diekson公司)、1%多聚甲醛、PBS磷酸盐缓冲液(本院自配)。1.2.3其他：Falocn上样管(美国Becton Diekson公司),微量移液器(德国eppendorf)、真空采血器、0.109mol/L枸橼酸钠抗凝管,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,一次性采血针。1.3实验步骤与方法：采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测富血小板血浆(PRP)中血小板膜表面CD62P、CD63日性率。1.3.1标本处理：患者经过大于72小时的洗脱期(试验前72小时内无出血事件、无用药记录)后进行采血,按照静脉采血指南采集吲,清晨空腹,使用大于20号针头一次性采血针采集肘前静脉的静脉血,为避免造成额外血小板活化采血过程中禁止使用止血带,将采血针插入EDTA抗凝管中,前2mL静脉血用于血小板计数检测,继续采集将2.7 mL静脉血沿试管壁缓慢注入0.109mol/L枸橼酸钠抗凝管(蓝色帽管),避免血样起泡,血液与抗凝剂比例为9：1。30分钟内处理血样,先将血样800rpm离心5分钟,吸取上层血浆,得到富血小板血浆(PRP)后血样按照下表加样处理。按照表1-1加样。1.3.2单克隆荧光抗体标记每个样本分别取4只上样管,如上分别加入荧光标记的同型单抗IgG1、CD61、 CD62P、CD63单克隆抗体,轻轻混匀,室温下避光孵育20分钟,使抗体与细胞表面标记充分结合,20分钟后加入5mL的pH7.4PBS,3000转/分离心5分钟,除去多余的未结合的单克隆荧光抗体,加入1%多聚甲醛0.5mL进行稀释,即刻上机检验。二、流式细胞术血小板源性微粒(PMPs)检测：2.1研究对象：根据Bethil TC分型方案,以FⅧ活性(FⅧ:C)2%界定重型血友病A患者,2012年2月至2014年4月间,从广东省血友病病例信息管理中心筛选登记的有完整病史资料的367例患者中,选取符合年龄大于18岁、因子替代治疗方案均为按需治疗,试验前72小时内无出血事件、无用药记录,排除FⅧ抑制物阳性(Bethesda法0.6BU)患者及合并其他基础疾病的重型血友病A患者。经知情告知,有31名患者符合要求并自愿加入本项研究,另招募有17名健康男性志愿者自愿加入本试验,均签署知情同意书。根据患者自发性出血频率,分别以出血频率6次/年、24次/年为分界点,定义近2年来患者自发性年出血频率≤6次/年为重型血友病轻度表型,24次/年为重型血友病重度表型[4],其中轻度表型10人,重度表型21人,健康成年男性志愿者17人为正常对照。各组年龄、体重均匹配。受试者BMI在正常范围。以上所采集血样用于血小板微粒检测。在重度表型按需治疗的患者中,有11人经患者同意我们在其基线状态、急性出血期、Ⅷ因子注射治疗后进行了静脉血采集PMPs检测。基线状态的标本采集符合72小时内无出血事件、无用药记录；急性出血期采血限制在出血事件发生后1小时内进行且采血前未使用凝血因子；Ⅷ因子注射(剂量15IU/kg)治疗采血在因子直射后8-12小时进行。通过比较受试者基线状态、急性出血期、因子治疗后PMPs的水平了解重度表型患者不同时期外周血PMPs水平及因子替代治疗对PMPs水平的影响。2.2主要仪器与试剂：2.2.1主要仪器：Thermo高速离心机(美国Thermo公司)、流式细胞仪检测(CantoII,美国Becton Diekson公司),THC-Z恒温振荡器(中国江苏太仓试验仪器厂)。2.2.2主要试剂：Mouse IgG1-PE(美国Becton Diekson公司)、CD41-FITC(美国Becton Diekson公司)、CD62P-PE(美国Becton Diekson公司)、CD63-PE(美国Becton Diekson公司)、1μm标准荧光微珠(Sigma-Aldrich公司产品,香港大学赠送)。1%多聚甲醛、PBS磷酸盐缓冲液(本院自配)。2.2.3其他：Falocn上样管(美国Becton Diekson公司),微量移液器(德国eppendorf)、真空采血器、0.109mol/L枸橼酸钠抗凝管,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,一次性采血针。2.3实验原理与步骤：2.3.1方法：患者经过大于72小时的洗脱期(试验前72小时内无出血事件、无用药记录)后进行采血,按照静脉指南采集,清晨空腹,使用大于20号针头一次性采血针采集肘前静脉的静脉血,为避免造成额外血小板活化采血过程中禁止使用止血带,将采血针插入EDTA抗凝管中,前2mL静脉血用于血小板计数检测,继续采集将2.7 mL静脉血沿试管壁缓慢注入0.109mol/L枸橼酸钠抗凝管(蓝色帽管),避免血样起泡,血液与抗凝剂比例为9：1。30分钟内处理血样,先将血样800rpm离心5分钟,吸取上层血浆,得到富血小板血浆(PRP)后,将富血小板血浆进行高速离心,1550g 20℃离心20分钟,充分去除血小板,留取上清液,1 8000g 20℃离心30分钟取上清。冻存于-80℃,后续统一流式细胞术进行微粒检测。上述实验过程所得标本37℃迅速复温,血小板特异性荧光抗体CD41-FITC标记PMPs,以标准微球进行定位对照和设置机器检测条件,调节机器阈值,设门计数并以PMPs占um CD41日性颗粒的百分比,检测静息状态下重型血友病不同临床表型患者与正常对照组PMPs水平、连续低剂量FⅧ预防治疗的重度表型患者基线期、急性出血期及治疗3月后PMPs水平。按照表2-1加样。加样后用室温避光孵育30分钟,使荧光单抗与血小板微粒特异性结合,检测前用PBS溶液将容积调整至0.5mL。上机检测：装满并检查鞘液桶,弃废液,打开FCM,仪器气路加压,排空气泡,校准仪器光路使之处于最佳状态,变异系数2%,建立前向角光散射对侧向角光散射双对数散点图(FSC LOG-SSCLOG),以直径为1μm的标准微球作为定位对照,根据定位对照,将仪器SSC的阈值调至200,FSC的增益和电压分别调至100和1000。在此条件下收集和分析到的信号均由PMPs和标准微球产生,并在同一条件下测定一管仅含去离子水的空白对照以此验证仪器噪音信号的干扰程度。PMPs流式细胞仪检测和门的设定用1μm的标准微球设定前向检测区,使用流式细胞仪检钡PMP CD41-PE的表达。对所设门内(微颗粒直径在0-1μm)的颗粒进行分析(图2-1),PMPs的界定：直径范围在0-1μm,表面标记CD41阳性。结果2.1一般病例资料比较：重型血友病重度表型组(n=21)平均年龄(23.5±5.33)岁,轻度表型组(n=10)平均年(28.9-±7.06)岁,正常对照组(n=17)(31.08±8.11)岁,各组间年龄差异不显著。重度表型组FⅧ活性(FⅧ：C)为(0.96±0.35)%,轻度表型组FⅧ活性为(1.04±0.24)%,两组FⅧ活性比较P值=0.304,差别不显著。2.2各组血小板计数的比较：重度表型组(n=21)平均血小板计数(292.5±83.69)G几,轻度表型组(n=10)血小板计数(256.3±60.52)G/L,正常对照组(n=17)血小板计数(239.5±50.82)G/L,轻度表型组与正常对照组间P值0.3519,差别不显著,重度表型组与正常对照比较P为0.369,重型血友病不同表型组间比较P=0.6217,差异不显著。2.3各组血小板CD62P表达率的比较：重度表型组(n=21)CD62P表达率均值为(36.2±9.27)%；轻度表型组(n=10)CD62P表达率均值为：(49±11.81)%正常组(n=17)CD62P表达率均值为(22.06±10.72)%。正常组与轻度表型均值比较,P值=0,差别非常显著；正常组与重度表型组比较,P值=0.001,差别非常显著；两组临床表型的重型血友病患者组间比较,P值=0.0408,差别显著。2.4各组血小板CD63的表达率的比较：重度表型组CD63表达(34.82±7.13)%；轻度表型组(51.15±14.3)%；正常组CD63表达为(19.08±17.05)%。正常组与轻度表型组比较,P值＝0,差别极其显著；正常组与重度表型组比较,P值=0.04,差别显著；两组临床表型的重型血友病患者组间比较P值0.0044,差别极其显著。2.5各组基线状态PMPs水平的比较：轻度表型组PMPs百分率均数±标准差为(2.06±1.33)%,重度表型组百分率均数±标准差为(0.95±0.64)%；正常组PMPs百分率均数为(1.06±1.20)%,各组间差异P值为0.02,各组间统计学差异显著。2.6重度表型患者不同时期PMPs水平比较：有11名重度表型患者参与了基线状态、急性出血期及FⅧ替代治疗后PMPs水平检测,所得数据进行配对样本t检验。患者PMPs基线水平为(0.85±0.18)%；急性出血期PMPs水平为(6.50±0.51)%；FⅧ替代治疗后PMP水平s为(0.45±0.40)%,急性出血期、基线、用药后PMPs基水平两两配对样本t检验P值为0,统计学差异非常显著。结论成人重型血友病A轻度表型患者血小板活化标志CD62和CD63表达高于重度表型者,且两者均高于正常对照组,差异显著,提示重型血友病患者血小板活化功能存在代偿活化,这种活化水平的差异可能是临床表型异质性的原因之一重型血友病A不同临床表型患者静息状态PMPs均高于正常人群,而且轻度表型的PMPs计数高于重度表型,结论与不同临床表型的重型血友病A患者血小板活化状态一致,说明PMPs同样参与血友病患者的代偿性促凝,是重型患者临床表现异质性的原因之一,血小板微粒水平可能能作为预测重型患者临床表型的指标。急性出血期与FⅧ注射后PMPs的变化更说明PMPs参与促凝止血功能的重要性。
【关键词】：血友病A 临床表现异质性 流式细胞术 P-选择素 血小板源性微粒
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R554.1
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-33
• 参考文献29-33
• 第一章 重型血友病A不同临床表型患者血小板活化功能的比较分析33-46
• 1 材料与方法35-39
• 2 结果39-41
• 3 讨论41-43
• 4 结论43
• 参考文献43-46
• 第二章 重型血友病A不同临床表型患者血小板微粒检测的比较分析46-59
• 1 研究对象与方法46-49
• 2 结果49-54
• 3 讨论54-56
• 4 结论56
• 参考文献56-59
• 全文小结与展望59-60
• 综述60-69
• 参考文献65-69
• 主要缩略词中英文对照表69-70
• 攻读硕士学位期间撰写的论文70-71
• 致谢71-72

【参考文献】

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1 ;《静脉采血指南/巴西临床病理学》[J];临床检验杂志(电子版);2013年04期

2 何敖林;陈军浩;方莹;;流式细胞术检测特发性血小板减少性紫癜患者血小板微粒[J];现代检验医学杂志;2008年01期

3 周莉莉;韩悦;朱倩;胡璐萍;赵世香;朱明清;戴兰;沈文红;陈黎;吴德沛;;组织因子微颗粒的检测及其在出凝血异常中的临床意义[J];中国实验血液学杂志;2012年04期

本文编号：1013727