肺动脉平滑肌细胞内BRCC36在介导cGMP抑制TGF-β信号中的作用

发布时间：2017-10-16 09:15

  本文关键词：肺动脉平滑肌细胞内BRCC36在介导cGMP抑制TGF-β信号中的作用

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【摘要】：目的：本研究旨在探讨BRCC36蛋白在介导cGMP抑制TGF-β信号中的作用,及其可能作用机制。方法：(1)：采用组织块贴壁法,进行肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)原代培养,本实验采用第三代细胞作为实验对象,并采用大鼠平滑肌细胞特异性表达分子α-SMA,经免疫荧光染色技术,对所培养细胞进行纯度鉴定。(2)：给予PASMCs cGMP (0.5mM)预处理1小时,而后再给予TGF-p 1 (2ng/ml)刺激12小时,提取细胞总RNA,以GAPDH为内参,采用RT-PCR的方法检测TGF-β1刺激标志物PAI-1的mRNA的表达情况。(3)：给予PASMCs, TGF-β1 (2ng/ml)刺激,选择12小时为时间点,提取细胞总蛋白,并采用Western blot的方法,以a-tubulin为内参,检测BRCC36蛋白的表达情况。(4)：分别给予给予PASMCs转染空载体腺病毒(AD-NULL)和携带BRCC36过表达基因的腺病毒(AD-BRCC36)后,再给予cGMP (0.5mM)预处理1小时,接着给予TGF-β1 (2ng/ml)处理12小时,提取总RNA,检测PAI-1的mRNA的表达情况。(5)：给予PASMCs转染AD-BRCC36后,先后给予微管解聚剂诺考达唑(5 ug/ml), cGMP (0.5mM)各处理1小时后,给予TGF-β1 (2ng/ml)刺激12小时,提取总RNA,采用RT-PCR的方法,检测PAI-1的mRNA的表达情况。结果：(1)所培养肺动脉平滑肌细胞,形状为梭形,并成放射性生长,状态良好,纯度达到95%以上,基本符合后续实验要求。(2)采用cGMP预处理的方法激活ANP-cGMP-PKG信号通路,可以明显抑制TGF-β1诱导的PAI-1的表达,并且能够降低PAI-1的基础表达。(3)在给予TGF-β1刺激后,PASMCs内,较空白对照组,内源性BRCC36表达增加。(4)在转染AD-BRCC36的PASMCs,相较转染AD-NULL, cGMP对TGF-β1诱导的PAI-1表达的抑制作用增强,并且过表达BRCC36能够减少细胞内PAI-1的基础表达。(5)微管解聚剂诺考达唑处理后,能够去除,过表达BRCC36增强cGMP抑制TGF-β1信号通路的作用。结论：去泛素化酶BRCC36能够增强cGMP对TGF-β的抑制作用,并且依赖于β2-tubulin的结构完整性。其可能机制是BRCC36对Smad蛋白在泛素化水平进行了调控,并促进其与β2-tubulin结合增加,从而阻止其入核。
【关键词】：BRCC36 心房利钠肽 去泛素化 转化生长因子 肺动脉高压
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1
【目录】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-7
• 英文缩写词7-8
• 第一章：前言8-11
• 第二章：材料与方法11-19
• 第三章：实验结果19-26
• 第四章：讨论26-32
• 第五章：结论32-33
• 参考文献33-36
• 综述36-42
• 参考文献40-42
• 致谢42-43
• 攻读硕士学位期间发表论文目录43-44

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1 徐欧繁;肺动脉平滑肌细胞内BRCC36在介导cGMP抑制TGF-β信号中的作用[D];扬州大学;2016年

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本文编号：1041840