MiR-132参与调控动脉粥样硬化过程中的初步研究

发布时间：2017-11-03 15:31

  本文关键词：MiR-132参与调控动脉粥样硬化过程中的初步研究

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【摘要】：动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种严重危害人类健康的常见病,是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础。到目前为止,AS的发病机制尚未完全清楚,存在多种学说,涉及多种危险因素,以至临床缺乏有效的防治药物。大量的基础和临床研究表明,致AS的危险因素包括高脂血症、高血压、高血糖(糖尿病)、高纤维蛋白原血症、高半胱氨酸血症、高尿酸血症、肥胖、肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAAS)活化、吸烟、凝血功能亢进(组织因子、凝血酶)、微量元素代谢失调(如铁、铜、锌、硒、铬、锰、锗等)、自体生物活性物质(如5-羟色胺、NO、内皮素一1等)代谢紊乱、慢性应激引起皮质醇类、儿茶酚胺类等应激激素的分泌使血流量和血压改变,导致内皮损伤和血小板黏附。在这些学说中,AS发病的炎症机制是相对新的一种学说,引起科学家的极大关注,并进行了大量的研究工作,取得了丰硕的成果,形成了普遍的共识。1999年,ROSS教授强调AS是一种慢性炎症性疾病。按照炎症反应的表现,AS的炎症反应可分为急性渗出性炎症和慢性增生性炎症。急性渗出性炎症主要见于AS早期,如单核巨噬细胞浸润；而慢性增生性炎症见于AS的进展期,主要表现为VSMCs大量增殖及细胞外基质过度合成。脂质代谢异常,在AS发生发展中是损伤内皮的主要因素。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对单核细胞具有趋化性,能上调内皮细胞产生单核细胞刺激因子(MCSF)和单核细胞趋化因子(MCP-1)。使单核巨噬细胞募集增殖,并使巨噬细胞分化成泡沫细胞,参与AS的形成和发展。在对炎症刺激的反应过程中,内皮细胞表达受炎症介质和过氧化脂质调节的蛋白酶,蛋白酶的激活可能切断内皮细胞与其血管内膜基质间的联系,促使内皮细胞从血管内膜剥离,引起血管内膜损伤。炎症可诱导低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的氧化修饰,而修饰的LDL-C可进一步导致动脉内膜的炎症过程,可见炎症可加速脂蛋白促AS形成作用。AS的发生是由于血管内皮细胞和平滑肌细胞受各种危险因子,血管局部产生的一种过度的慢性炎性增生反应。内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞始终是构成AS的三要素。多种MicroRNA在上述细胞上特异性表达,通过调节内皮细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞的多种功能参与As发病过程,目前大部分的文献来自血管疾病及血管生成的研究,主要集中于内皮细胞的完整性及参与血管形成的能力,血管平滑肌细胞的增殖及巨噬细胞对致As脂质的炎症应答。而miRNA对单核/巨噬细胞、内皮细胞及血管平滑肌细胞的功能均有调节作用。因此,miRNA可通过调节这3种细胞功能而影响动脉粥样硬化的发生发展并成为抗动脉粥样硬化的靶点。动脉粥样硬化(AS)是由多种原因造成胆固醇等脂质沉积于动脉内膜下,并发平滑肌细胞(SMC)聚积,继而纤维组织增生和钙质沉着、斑块内出血和血栓形成,最终致动脉管壁变硬、管腔狭窄甚至闭塞而引发临床事件。AS是一个慢性复杂的病变过程,血脂等异常时,血管内皮细胞(VEC)损伤,血小板聚集并释放血小板因子,血液中单核细胞进入内皮下被激活成巨噬细胞,并吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)，，血管中层的SMC向损伤的内膜迁移、浸润、增殖,使血管内膜增厚、纤维化、粥样斑块形成及管腔狭窄、闭塞。最终引发心、脑血管事件。因此,VEC、SMC、巨噬细胞及某些细胞因子等都参与了AS的发生与发展。Micro RNA影响血管内皮细胞的功能,参与血管平滑肌细胞的迁移和增殖在动脉粥样硬化的形成过程中,血管壁细胞,如EC和VSMC的变化发挥了重要作用。内皮细胞功能障碍增加了内皮层的通透性和相应细胞因子和黏附分子的表达,减少了内皮层的再生。VSMC的迁移及增殖则促进了粥样斑块的形成,加速了冠状动脉粥样硬化的进程。而内皮细胞和平滑肌的功能障碍及迁移、增殖均可受Micro RNA的调控。miR-let-7c通过抑制Bcl-xl的表达,促进了内皮细胞的凋亡,并参与促进动脉粥样硬化,而miR-126通过加强内皮细胞的修复,发挥了抗动脉粥样硬化的作用。miR-126也可能通过直接抑制血管内皮生长因子(VEGF)通路的负性调节因子,如Sprouty相关蛋白SPRED1和磷酸肌醇激酶3的Ⅱ型调节亚基(PIK3R2/p85-b)来调节内皮细胞对VEGF的应答。miR-221和miR-222通过抑制其靶点p27和p57,促进了VSMC的增殖。miR-143和miR-145在平滑肌细胞中表达丰富,并有较高保守性,他们参与平滑肌细胞的分化和迁移。miR-143和miR-145的缺失或减少可以促进VSMC的迁移、增殖和分化,从而促进冠状动脉粥样硬化。越来越多的证据表明, mi RNA在调节与动脉粥样硬化病变进展密切相关的血管新生、炎症和脂质代谢等方面发挥了重要作用。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类生物内源进化上保守的非编码小RNA,长度为22 bp左右。 1993年,Lee等首次在线虫中发现miRNA (lin-4) 。已有大量研究表明,miRNA在癌症、心血管疾病、纤维化疾病等多种疾病中都扮演重要角色。miRNA的生物学功能主要是通过完全或不完全的碱基互补配对,作用于靶mRNA的3’非翻译区(UTR),与相关蛋白共同构成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),从而对靶基因发挥调控作用。2002年,马克斯普朗克学会的Lagos-Quintana等在小鼠神经组织中首次发现了miR-132；随后,分别在人、斑马鱼、牛等不同物种的不同组织中有了发现。miR-132在癌症、机体感染、心血管疾病、神经系统调节等方面均发挥重要作用,在此,我们就miR-132在心血管疾病调节方面的生物学功能进行简要综述。作为内皮细胞特异性miRNA之一,miR-132通过作用于新生血管刺激因子,在血管新生过程中起调节作用。在血管内皮细胞中,miR-132通过调节GTP酶活化蛋白p120RasGAP,参与静态内皮细胞活化、增殖、迁移及毛细血管生成。Sudarshan等通过对比发现,人肿瘤胚胎干细胞和血管瘤细胞中miR-132高表达,并直接作用于p120RasGAP基因的3’UTR。在正常血管内皮细胞形成或再生过程中,形成血管内壁的内皮细胞中miR-132的表达升高,从而导致静态细胞活化,血管开始生长扩张。对患有癌症和视网膜疾病的小鼠眼球转染miR-132模拟物(miR-132 mimic)及拮抗剂(anti-miR-132),发现miR-132拮抗剂可以抑制小鼠病变部位血管生长, 阻止病情发展。miR-132在HSV引起的慢性角膜炎组织中高表达,通过作用于血管内皮细胞生长因子(VEGF),参与病毒感染恢复期血管修复过程。HSV感染后,降低VEGF-A的活性则导致miR-132表达的上升；IL-17受体敲除小鼠在感染HSV后miR-132的表达也增加。可见miR-132对IL-17和VEGF同样起到负调控作用。用携带anti-miR-132的纳米粒子作用于感染HSV的小鼠角膜,结果显示anti-miR-132可以减少角膜血管新生,降低角膜炎损伤。目的：探讨miR-132的在动脉粥样硬化过程中的促炎性作用。方法：1、利用在线软件DIANA microT v4.0 (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/)预测能与SIRT 1结合的microRNAs;根据GeneCards (http://www.genecards.org)检索SIRT1的3’-UTR序列,利用Vector NTI Advance 11.5.1软件设计PCR扩增引物,限制性内切酶酶切位点为EcoR V和BamH I.引物序列分别为：上游：5’-GGGAAGTACATCAAGAGCTTCGT-3';下游：5'- CCCCCTGAACCTG AAACATAAA-3'。2、培养人脐静脉内皮细胞,瞬时转染miR-132 mimics和inhibitor,继续培养细胞,提取内皮细胞总RNA和总蛋白,进行western blot和real-time PCR,检测SIRT1及其下游调节基因SREBP、 FASN和HMGCR的表达水平；3、培养人脐静脉内皮细胞,用不同浓度的TNF-a处理人脐静脉内皮细胞4小时,然后提取内皮细胞的细胞蛋白,进行western blot检测ICAM1(细胞间粘附分子1)和MMP9(基质金属9)等炎症相关蛋白表达水平的表达水平。另外,我们还使用Elisa检测了细胞培养液上清中可溶性ICAM (sICAM1)水平；4、培养人脐静脉内皮细胞,用miR-132或miR-132inhibitor预处理内皮细胞48小时,然后接着用或不用TNFa (10ng/mL)处理细胞24小时。然后提取细胞中总蛋白,进行western blot检测CAM1(细胞间粘附分子1)和MMP9(基质金属9)等炎症相关蛋白的表达水平；5、培养人脐静脉内皮细胞,设计寡聚核苷酸阻断内皮细胞中内源性的miR-132的表达,在使用或不使用TNF-α的促炎过程中,提取细胞总蛋白,进行western blot检测SIRT1、SREBP-1c和其下游的基因表达的表达情况；结果：1、首先我们使用在线软件DIANA microT v4.0 (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/)预测是否存在一个或者更多的miRNAs作用于SIRT1上在所检索到的miRNA中,我们发现miR-132能够作用于SIRT1 mRNA的3’非编码区。为了进一步验证miR-132能否直接与SIRT1的3’非编码区结合,我们进行3'UTR萤光素酶报告基因检测,发现与对照组相比,转染miR-132后,内皮细胞中SIRT1的3’非编码区的荧光素酶活性(0.3384-0.036)显著降低(P=0.000)。结果证实,SIRT1的mRNA是的miR-132的直接目标。2、验证了miRNAs能够调控内皮细胞中SREBP-脂肪生成-胆固醇生成途径,而SREBPlc, FASN和HMGCR是脂肪酸和胆固醇的从头合成的重要的酶。我们转染miR-132 mimics和inhibitor至人脐静脉内皮细胞中,继续培养24小时,提取细胞中总RNA,按照步骤进行了RT-PCR,结果显示miR-132能够抑制SIRT1 mRNA的表达,同时也抑制了他们下游调节基因SREBP (0.45±0.07)、 FASN (0.55±.09)和HMGCR mRNA水平(0.6-0.08)。培养48小时后,提取细胞内总蛋白,进行western blot检测SIRT1的蛋白表达水平。结果显示：miR-132能够在蛋白水平抑制SIRT1的表达(P0.01),同时也抑制了他们下游调节基因SREBP、FASN和HMGCR蛋白水平的表达。3、研究表明,TNF-α毙够参与机体的炎症反应。为了炎症TNF-α能够诱导内皮细胞的炎症反应,我们用不同浓度的TNF-α处理人脐静脉内皮细胞4小时,然后提取内皮细胞的细胞蛋白,进行western blot检测炎症相关蛋白的表达水平,结果发现,ICAM1(细胞间粘附分子1)和MMP9(基质金属9)等蛋白表达水平明显增多(如图2-1)。另外,我们还使用Elisa检测了细胞培养液上清中可溶性[CAM (sICAM1)水平,结果发现,与对照组相比,上清中可溶性ICAM (sICAM1)显著增多(如图2-2：对照组：0.38±0.04;5 ng/mL 0.62±0.11;10 ng/mL 0.87±0.09;50 ng/mL 0.93±0.14),这些结果说明：TNF-a能诱导人脐静脉内皮细胞的炎症反应。4、明确了内皮细胞中miR-132能否促进炎症发生,我们先用miR-132或miR-132inhibitor预处理内皮细胞48小时,然后接着用或不用TNFα (10 ng/mL)处理细胞24小时。然后提取细胞中总蛋白,进行western blot检测炎症相关蛋白；结果显示,miR-132能够诱导内皮细胞中sICAM1水平增高以及ICAM1和MMP9在内皮细胞中的表达。而且,miR-132和／或TNFa诱导的sICAM1水平升高以及ICAM1的的表达能够被miR-132 inhibitor抑制(c vs.e,P0.01;d vs.f,P0.01)(Fig.3b：c vs.e,P0.01;d vs.f, P0.01)(a,0.38±0.04;b,0.87±0.09;c,1.33±0.18;d,1.54±0.14;e,0.18±0.03;f, 0.56±0.04)。这些数据表明,miR-132能促进人脐静脉内皮细胞的炎症发生。5、研究了miR-132诱导人脐静脉内皮细胞炎症发生与SREBP-脂肪生成-胆固醇生成的相关性,我们设计寡聚核苷酸阻断内皮细胞中内源性的miR-132的表达,在使用或不使用TNF-α的促炎过程中,提取细胞总蛋白,进行western blot检测SIRT1、SREBP-1c和其下游的基因表达的表达情况,结果发现阻断内源性miR-132后,使用TNF-α诱导内皮细胞炎症反应,发现SIRT1、 SREBP-1c和其下游的基因表达明显增多,与不使用TNF-α诱导内皮细胞炎症反应时无明显变化；而miR-132能够抑制：SIRT1、SREBP-1c和其下游基因的表达。这些结果说明,miR-132可诱导与SREBP-脂肪生成-胆固醇生成相关的人脐静脉内皮细胞炎症发生。结论：1、生物信息学分析示,miR-132能直接结合于SIRT1的3'非编码区：2、miR-132抑制人脐静脉内皮细胞中SIRT1、SREBP1-c和及其下游基因的表达：3、miR-132对动脉粥样硬化过程中促炎性作用；4、miR-132可诱导与SREBP-脂肪生成-胆固醇生成相关的人脐静脉内皮细胞炎症发生；
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

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本文编号：1136807