柯萨奇病毒感染小鼠心肌细胞及心脏成纤维细胞后CD80与CD86的表达情况

发布时间：2017-11-16 10:04

  本文关键词：柯萨奇病毒感染小鼠心肌细胞及心脏成纤维细胞后CD80与CD86的表达情况

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【摘要】：目的:病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是指由病毒感染引起的心肌疾病,其中最常见的原因是由柯萨奇病毒B3(Coxsackie virus B3,CVB3)感染。病毒感染以后引起心肌炎的发病机制尚未完全阐明,目前较多的研究认为是病毒直接损伤和感染后机体的免疫反应引发的炎症性损伤。病毒性心肌炎可发展为扩张性心肌病,儿童发病后致死致残率较高,且到目前为止临床仍然缺乏特效的治疗方法。因此对于CVB3感染以后引起病毒性心肌炎的发病过程以及治疗方法的研究都非常有必要。心脏中除了最有功能的心肌细胞以外,还有50%的细胞为成纤维细胞。所以对心脏心肌细胞和成纤维细胞在CVB3刺激以后产生的反应进行研究,可以为研究病毒性心肌炎的发病过程及找到有效的治疗方法提供一定的依据。方法:1体外培养C57BL/6小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞:无菌操作取新生C57BL/6小鼠心脏,取出后,放入不含有血清和抗生素的DMEM高糖培养基中。先除心脏以外的组织,再使用吸管反复吹打进行冲洗,冲洗完的心脏中重新加入少量不含血清和双抗的DMEM高糖培养基。用无菌剪刀将其剪碎,依次用胰酶与Ⅱ型胶原酶消化后,用铜网过滤。将滤液收集到离心管中进行离心。去掉上清液后再离心一次,再次弃去上清液,加入含有血清和双抗的DMEM高糖培养基。吹散后将细胞铺入六孔板内。90分钟后,把孔内未贴壁的细胞吸出移至新的六孔板中,向剩余孔内再加入新鲜的含血清DMEM高糖培养基(采用1.5小时差速贴壁法分离培养小鼠心肌细胞与心脏成纤维细胞)。最后将六孔板放入CO_2培养箱内37℃进行培养。2培养经柯萨奇病毒感染后的小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞并且观察细胞病变。3细胞CD80和CD86的表达情况测定:Trizol法提取细胞总RNA,按照试剂说明提取感染柯萨奇病毒后不同时间点的心肌细胞总RNA和心脏成纤维细胞总RNA。本实验中心肌细胞感染柯萨奇病毒后选择的时间点分别为1天、3天、5天、7天、9天;心脏成纤维细胞感染柯萨奇病毒后选择的时间点分别为3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时。未感染病毒的正常细胞作为对照组,进行Real Time PCR扩增,观察细胞CD80和CD86的表达情况。结果:1小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞能够进行体外培养并且生长状况良好。2观察柯萨奇病毒感染后的细胞发现:小鼠心肌细胞中部分细胞出现了病变,而小鼠心脏成纤维细胞中只有少量细胞出现了病变。3进行Real Time PCR后,结果显示:感染柯萨奇病毒以后,心肌细胞中CD80的mRNA的表达在第1天骤然下降,而后开始升高,在第3天达到高峰,接着又开始下降,第5天、第7天、第9天持续下降,整个过程均在正常水平以下;CD86的mRNA的表达同样在第1天明显下降,而后开始升高,在第3天达到高峰,接着开始下降,第5天、第7天、第9天持续下降,整个过程均在正常水平以下。Real Time PCR的结果也显示,在被柯萨奇病毒感染以后,心脏成纤维细胞中CD80的mRNA的表达在3小时、6小时、12小时、24小时持续下降,24小时降至最低点,接着开始上升,48小时、72小时持续上升,整个过程均在正常水平以下;CD86的mRNA的表达在3小时、6小时持续下降,6小时降至最低点,但在12小时突然升高,超过正常水平,达到最高峰,接着24小时又下降,但在48小时又升高,达到第二个高峰,第二个高峰在正常水平以下,在72小时又下降。结果表明CD80和CD86的低表达可能是造成成年人早期感染CVB3以后,免疫损伤较轻而病毒直接损伤较重的原因。结论:1 CVB3感染以后,早期病毒主要对部分小鼠的心肌细胞进行破坏,而并未明显损伤心脏成纤维细胞,小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞在体外培养时均有增殖。2 正常小鼠的心肌细胞和心脏成纤维细胞中均表达CD80与CD86mRNA。3 在小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞被CVB3感染以后,细胞内的CD80与CD86mRNA的表达均会出现波动性的变化,且均有明显的表达降低。由此我们可以认为感染早期低表达的CD80和CD86可与细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)结合,负性调节,抑制T细胞的增殖,使T细胞无法发挥细胞免疫的作用而致使病情继续发展。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.21

【参考文献】

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1 孙景辉;翟淑波;;病毒性心肌炎发病机制的研究进展[J];临床儿科杂志;2012年07期

2 庄建新,马沛然,王玉林,李秋波,徐海燕,于永慧;静脉滴注人血免疫球蛋白对病毒性心肌炎心肌细胞凋亡与坏死的影响[J];实用儿科临床杂志;2005年03期

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本文编号：1191957